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Funktionelle Charakterisierung unkonventioneller Myosine aus Dictyostelium discoideum

Dürrwang, Ulrike

English Title: Functional Characterization of Unkonventional Myosins from Dictyostelium discoideum

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Abstract

Myosine bilden eine große Familie von aktinbindenden Motorproteinen. In der vorliegenden Arbeit wurden neben der zellulären Lokalisierung die mechanischen und biochemischen Eigenschaften von Myosinen der Klasse I aus dem Modellorganismus Dictyostelium discoideum charakterisiert. MyoD und MyoE liegen angereichert in dynamischen Regionen des Zellcortex und an aktinreichen Membranstrukturen vor. Während der Mitose ist MyoD an Teilen des Spindelapparats und an der Kernhülle lokalisiert, die während der Zellteilung erhalten bleibt. Mit einer direkten funktionellen Methode wurde in vitro gezeigt, daß die Bewegungsgeschwindigkeit von MyoB, MyoD und MyoE durch eine Phosphorylierung an der TEDS-Stelle in der Motordomäne stark bis zu sechsfach erhöht wird. Auch eine effiziente Aktinaktivierung der ATPase-Aktivität erfordert eine negative Ladung an dieser Position. Dadurch wird die Kopplung zwischen der Aktinbindung und der Freisetzung des Reaktionsprodukts Phosphat bis zu 80-fach gesteigert. Mit transientenkinetischen Messungen konnte nachgewiesen werden, daß der Aktomyosinkomplex durch die negative Ladung stabilisiert wird. Durch einen zweiten Regulationsmechanismus wird die Bewegungsgeschwindigkeit von MyoD von freien Magnesiumionen in einem physiologischen Konzentrationsbereich inhibiert, indem die Dissoziation des Hydrolyseprodukts ADP gehemmt wird. Weitere Unterschiede zwischen den drei Myosinen wurden bei den Geschwindigkeits- und Gleichgewichtskonstanten von wichtigen Schritten des ATPase-Zyklus deutlich. Die ADP-Affinität von MyoB und MyoD wird bis zu 50-fach durch Aktin erniedrigt. Im Gegensatz dazu bleibt die ADP-Affinität von MyoE auch nach der Bindung an Aktin hoch. Dadurch ist die geschwindigkeitsbestimmende Dissoziation von ADP aus dem Aktomyosinkomplex von MyoE langsamer als die von MyoB oder MyoD, was zu einer langsameren Bewegung von Aktinfilamenten führt.

Translation of abstract (English)

Myosins form a large family of actin-binding motor proteins. In addition to the localization the mechanical and biochemical properties of class-I myosins from the model organism Dictyostelium discoideum were characterized in the presented thesis. MyoD and MyoE are enriched in dynamic regions of the cell cortex and at actin-rich membrane structures. During mitosis MyoD is localized at parts of the mitotic spindle and at the nuclear envelope, which is maintained during cell division. Using a direct functional assay it could be shown that the in vitro motility of MyoB, MyoD, and MyoE is increased up to 6-fold by phosphorylation of the TEDS-site in the motor domain. Also the efficient actin-activation of the ATPase activity requires a negative charge at this position. This leads to an enhancement of the coupling between actin binding and release of the product phosphate up to 80-fold. Transient kinetic measurements showed that the actomyosin complex is stabilized via the negative charge. In a second regulation mechanism the motility of MyoD is inhibited by free magnesium at physiological concentrations, as the rate of dissociation of the hydrolysis product ADP is decreased. More differences among the three myosins are obvious in the rate and equilibrium constants of important steps of the actomyosin ATPase cycle. The ADP-affinities of MyoB and MyoD are reduced up to 50-fold by the addition of actin. In contrast the ADP affinity of MyoE is high also upon binding to actin. Therefore the rate limiting release of ADP from the actomyosin complex is significantly slower for MyoE than for MyoB and MyoD, resulting in a decelerated movement of actin filaments.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Holmes, Prof Kenneth C.
Date of thesis defense: 6. February 2003
Date Deposited: 02. Apr 2003 12:48
Date: 2002
Faculties / Institutes: Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Myosin, Dictyostelium discoideum, Kernhülle, Phosphorylierung
Uncontrolled Keywords: TEDS-Stelle , TransientenkinetikTEDS-site , transient kinetics
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