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Funktionelle Charakterisierung antioxidativer Enzyme aus Toxoplasma gondii

Ding, Martina G.

English Title: Functional characterisation of antioxidant enzymes from Toxoplasma gondii

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PDF, German
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Abstract

Im Stamm Apicomplexa, zu dem der obligat intrazelluläre Parasit Toxoplasma gondii gehört, waren bis zum Beginn dieser Doktorarbeit noch keine Peroxisomen beschrieben, ein in fast allen eukaryontischen Zellen vorkommendes Organell. Das Markerprotein von Peroxisomen ist das Enzym Katalase, welches Wasserstoffperoxid (H2O2) detoxifiziert. Nach Vorarbeiten in meiner Diplomarbeit wurden Cosmide zur Verfügung gestellt, die die genomische Sequenz der Katalase enthielten. In dieser Doktorarbeit wurde die Sequenz der T. gondii Katalase ermittelt, bei der es sich um eine typische Katalase handelt. Darüber hinaus befindet sich am C-Terminus ein sogenanntes PTS1-Signal, welches für den Import in Peroxisomen notwendig ist. Es wurden Antikörper hergestellt, um die Katalase innerhalb der Zelle zu lokalisieren und mögliche Peroxisomen zu identifizieren. Die vier Seren detektierten im Westernblot eine distinkte Bande, in der Immunfluoreszenzanalyse (IFA) jedoch unterschiedliche Epitope, die einzige Gemeinsamkeit war eine zytosolische, zellzyklus-abhängige Färbung der Zellen. Eines der Seren detektierte eine apikale Struktur in der IFA, welche ein mögliches Peroxisom darstellte. Durch Doppelimmunfluoreszenzanalyse konnte gezeigt werden, dass es sich um eine noch nicht identifizierte Struktur handelte. In dieser Doktorarbeit durchgeführte Fraktionierungsmethoden, sowie Importstudien mit GFP-PTS1 Fusionsproteinen ließen auf eine zytosolische Lokalisation der Katalase schließen. Durch das Ausschalten des Katalase-Gens konnte gezeigt werden, dass die Katalase in T. gondii tatsächlich zytosolisch ist und zellzyklus-abhängig exprimiert wird. Die Funktionalität der Katalase wurde durch einen Enzym-Assay überprüft und die Empfindlichkeit Katalase-defizienter Toxoplasmen gegenüber H2O2 getestet. Durch die Infektion von Mäusen wurden Hinweise für Unterschiede in der Virulenz von Wildtyp und Katalase-defizienten Toxoplasmen gewonnen. Diese Ergebnisse lassen, zusammen mit der ungewöhnlichen Lokalisation der T. gondii Katalase, auf eine Rolle dieses Enzyms unter oxidativen Stressbedingungen schließen. Peroxisomen konnten bisher nich identifiziert werden. Außerdem wurden die Gene zweier weiterer antioxidativer Enzyme aus T. gondii kloniert und in der Zelle lokalisiert, um ihre potentielle Rolle im Zusammenspiel mit der Katalase zu ermitteln. Es handelt sich um Proteine aus der Familie der Peroxidoxime, die in der Lage sind, diverse Peroxide zu detoxifizieren. Eventuell ist eines davon auch in der Lage, als Phospholipase A2 zu wirken. Ihre funktionelle Charakterisierung sowie die Identifizierung weiterer Komponenten des antioxidativen Systems in T. gondii sollten wertvolle Hinweise über das Zusammenspiel zwischen Wirt und Parasit liefern.

Translation of abstract (English)

When starting this thesis, there was no hint for peroxisomes, organelles existing in almost all eurayotic cells, in the phylum Apicomplexa, where the obligat intracellular parasite Toxoplasma gondii belongs to. A commom marker protein for peroxisomes is the enzyme catalase, which detoxifies hydrogen peroxide (H2O2). After preliminary work during my diploma thesis cosmids were put at my disposal which contained the genomic sequence of the catalase. During this thesis, the sequence of the T. gondii catalase was determined, which revealed to be a typical catalase. Moreover, a so-called PTS1 signal is present at the C-terminus which is necessary for the import into peroxisomes. To localise the catalase in the cell and to identify possible peroxisomes, antibodies were raised. The four sera detected on distinct band with the western blot method but recognised different epitopes in the immunofluorescence assay (IFA), the only common ground being a cytosolic, cell-cycle dependent staining of the cells. One of the sera detected an apical structure in the IFA, which represented a possible peroxisome. By double immunofluorescence analysis it shown that it was a yet non-identified structure. From different fractionation methods together with import studies using GFP-PTS1 fusion proteins it could be inferred that the catalase is cytosolically localised. By eliminating the catalase gene it could be displayed that the catalase in T. gondii is indeed cytosolic and expressed in a cell-cycle dependet way. The function of the T. gondii catalase was checked with an enzyme-assay using several cell lines produced during this thesis, including catalase-overexpressing and catalase-deficient Toxoplasma in different strains. The sensitivity of catalase deficient Toxoplasma towards H2O2 was also tested and compared to the behavior of catalase-overexpressing Toxoplasma. Hints for differences in the wildtype, catalse-overexpressing and catalase-deficient Toxoplasma were obtained by infecting mice. The results collected during this thesis, together with the quite unusual localisation of the T. gondii catalase point towards a role of this enzyme under oxidant stress conditions. To date no peroxisomes could be identified in Toxoplasma. Besides, the genes of two additional antioxidant enzymes of T. gondii were cloned, stable cell lines expressing tagged versions of these proteins were produced and the enzymes localised in the parasite to determine their potential role in T. gondii. They belong to the family of peroxidoximes which are capable of detoxifiying several peroxides. One of the two might be able to have an additional function as phospholipase A2. Their functional characterisation as well as the identification of further components of the antioxidant system should give precious hints about the interaction of parasite and host.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Clayton, Prof. Dr. C.E.
Date of thesis defense: 16. May 2002
Date Deposited: 25. Jun 2003 12:22
Date: 2002
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: enzyme
Uncontrolled Keywords: antioxidative Enzyme , Toxoplasma gondiiantioxidant enzymes , Toxoplasma gondii
Additional Information: Teile in: Journal of Cell Science
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