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Funktionalisierte Nukleinsäuren : Studien & Selektion von Ribozymen

Schlatterer, Jörg Christian

English Title: Functionalized Nucleic Acids : Studies & Selection of Ribozymes

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PDF, German
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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die für die in vitro Selektion katalytisch aktiver Nukleinsäuren erforderlichen Techniken weiterentwickelt und die Einsetzbarkeit von Ribozymen in der organischen Chemie unter qualitativen und quantitativen Gesichtspunkten evaluiert. Für die in vitro Selektion neuer RNA/DNA-Katalysatoren ist generell die Derivatisierbarkeit von Nukleinsäuren essentiell. Je mehr Möglichkeiten bestehen, in Oligonukleotide funktionelle Gruppen einzuführen, desto größer ist die mögliche Diversität zu isolierender Katalysatoren. Innerhalb dieser Doktorarbeit konnten generell zwei unterschiedliche Funktionalisierungsansätze erarbeitet werden. Über enzymatische Reaktionen konnten sowohl an terminalen wie auch an molekülinternen Positionen von Nukleinsäuren Funktionalitäten eingefügt werden. Die Synthese zweier Initiatornukleotide zum terminalen Einbau einer Thiol- bzw. Amino-Funktionalisierung in Ribonukleinsäuren ist ein Ergebnis dieser Arbeit. Die jeweilige Struktur der Initiatornukleotide konnte mittels MALDI-MS gesichert, ihr Einbau durch T7-RNA-Polymerase in Oligonukleotide per Autoradiographie von Polyacrylamidgelen gezeigt und durch anschließende Umsetzung mit Biotinmaleimid (Initiator-SH-nukleotid) bzw. Sulfo-NHS-Biotin (Initiator-NH2-nukleotid) ihre Derivatisierbarkeit bewiesen werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die molekülinterne Funktionalisierung von Desoxyribonukleinsäuren durch Verwendung einer sequenzspezifischen Methyltransferase (M.TaqI) und eines biotinylierten Cofaktoranalogons möglich ist. Die intern funktionalisierte DNA konnte mittels PCR amplifiziert werden. Dadurch wurde die Kompatibilität mit einem aufgestellten Selektionsschema bewiesen. Die Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen wird als essentieller Bestandteil im Metabolismus einer hypothetischen RNA-Welt angesehen. Künstliche RNA-Katalysatoren wie das in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Diels-Alderase-Ribozym können diese These stützen und darüber hinaus Ausgangspunkt für den Einsatz in vitro selektierter Biokatalysatoren in der Wirkstoffsynthese darstellen. Die praktische Verwendung solcher maßgeschneiderter Ribozyme in der Synthese hängt von den Produktionskosten, Stabilität und Effektivität des Katalysators ab. In Hinblick auf die zukünftige Wirtschaftlichkeit ribozymkatalysierter Reaktionen wurde hier partiell die Technologiebasis für einen Ribozymreaktor geschaffen. Das 49-mer-Minimalmotiv des Diels-Alderase Ribozyms wurde nahezu quantitativ kovalent an einer Festphase immobilisiert. Die katalytische Aktivität und Selektivität blieben dabei erhalten. Die aktivierte Festphase wies eine sehr gute Langzeit-Stabilität auf. Dadurch wurden wesentliche Kriterien bezüglich der Konstruktion eines Ribozymreaktors zur ökonomischen Synthese erfüllt. Zur Umsetzung dieser Idee muss die Effektivität des immobilisierten Ribozyms gesteigert werden. Um dieses Ziel zu erreichen wurden neue, effektivere Diels-Alderasen generiert und charakterisiert. Dabei wurden katalytische RNAs aus einer angereicherten, kombinatorischen RNA-Bibliothek mit Hilfe der in vitro Selektionstechnik durch Einsatz einer Quenched-Flow-Apparatur isoliert. Der Selektionsdruck wurde durch das Herabsenken der Reaktionszeit bis in den Millisekundenbereich erhöht. Nach 17 Selektionsrunden wurde die Selektion beendet. 19 Diels-Alderase-Ribozyme konnten nach Klonierung und Sequenzierung mittels fluoreszenzspektromtetrischen Assays kinetisch charakterisiert werden. Demnach beschleunigen die aktivsten Sequenzen die Reaktion zwischen Anthracen-Konjugat und Biotinmaleimid um das ca. 72000fache und weisen eine apparente Geschwindigkeitskonstante von ca. 940 M-1s-1 auf. Die aktivsten Sequenzen der Selektion beschleunigen die Diels-Alder-Reaktion 3.5 mal besser als das bislang immobilisierten 49-mer des Diels-Alderase-Ribozyms in vergleichbaren Studien.

Translation of abstract (English)

Within this thesis the techniques for the in vitro selection of catalytic active nucleic acids were refined and the organic-chemical application of ribozymes was evaluated with respect to qualitative and quantitative aspects. Generally, the possibility to form derivatives is essential for in vitro selection of new RNA enzymes. The more functional groups can be inserted into oligonucleotides the broader is the diversity of catalysts to be isolated. Within this research work two different ways to functionalize nucleic acids could be presented. It was possible to insert enzymatically functionalities at teminal and internal positions of oligonucleotides. This resulted in the synthesis of two initiator-nucleotides for terminal integration. The structure of the amino- and thiol-initiators could be confirmed by MALDI-MS. Using T7 polymerase their enzymatic integration in RNA could be shown by autoradiography of polyacrylamide gels. Such conjugates were converted successfully with biotinmaleimide (initiator-SH-nucleotide) and sulfo-NHS-biotin (initiator-NH2-nukleotide), proving the possible generation of RNA derivatives. Further, the sequence-specific, methyltransferase (M.TaqI)-induced labeling of DNA demonstrated the possible integration of a biotinylated aziridine cofactor into oligonucleotides. Such internally functionalized DNA could be amplified by PCR. Thereby the compatibility concerning the advanced selection scheme was shown. C-C bond formation is essential in metabolism of a hypothetical RNA world. Artificial RNA catalysts (such as the Diels-Alderase ribozyme developed in our group) support this theory. In addition in vitro selected biocatalysts can be the origin for ribozyme application in active agent chemistry. The practical use of reaction-tailored RNA enzymes in synthesis depends on their production costs, their stability as well as their efficiency. This thesis contributed to the development of a technology platform based on economic ribozyme catalyzed reactions. The 49mer minimal motif of the Diels-Alderase was attached covalently to a solid phase in a near-quantitative manner. Its catalytic activity and selectivity was maintained for many cycles of catalysis. The activated resin showed excellent long-term stability. Thereby, important basic prerequisites for the construction of a ribozyme reactor were accomplished. The immobilization of Diels-Alderase ribozymes with higher rate accelerations has been necessary for enhancing the efficiency of such a reactor. Therefore new and more effective Diels-Alderases were generated and characterized. By using a quenched-flow-apparatus, catalyzing RNAs were isolated from a combinatorial RNA library. The selection pressure was increased by decreasing reaction time down to milliseconds. The selection was stopped after 17 cycles. After cloning and sequencing 19 Diels-Alderase ribozymes could be characterized by fluorometric assays. According to these measurements, the most active sequences accelerate the reaction between anthracene-conjugates and biotinmaleimide up to 72000fold. They show an apparent velocity constant of about 940 M-1 s-1. The most active sequences accelerate the Diels-Alderase reaction 3.5 fold better than the up to now immobilized 49mers of the Diels-Alderase ribozyme in comparable studies.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Dr. Andres
Date of thesis defense: 31 July 2003
Date Deposited: 25 Aug 2003 14:51
Date: 2003
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Ribozym, Immobilisiertes Enzym, Diels-Alder-Reaktion
Uncontrolled Keywords: in vitro Selektion , Initiatornukleotidein vitro selection , initiator nucleotides
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