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Funktionelle Bedeutung der Protein-Kinase C eta im Infektionszyklus des autonomen Parvovirus Minute Virus of Mice

Lachmann, Sylvie

English Title: Functional relevance of the protein kinase C eta for the life cycle of the autonomous parvovirus Minute Virus of Mice

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PDF, German
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Abstract

Das multifunktionale große Nichtstruktur Protein NS1 des autonomem Parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) wird posttranslational modifiziert und zumindest teilweise über Phosphorylierung reguliert. Aufgrund seiner enzymatischen Funktionen, wie die ATPase-, Helikase- und Nickase-Aktivitäten ist NS1 essentiell für die Initiierung der viralen Replikation. NS1 ist außerdem in der Lage, heterologe Promotoren zu transregulieren und wirkt zytotoxisch auf die Wirtszelle. Die atypische PKClambda -Isoform phosphoryliert und aktiviert NS1 für Helikase-Funktionen. Diese Aktivierung allein ist jedoch nicht ausreichend, um das virale Protein für die rollende Haarnadelreplikation (rolling circle replication) in vitro zu stimulieren. In der vorliegenden Arbeit konnte eine weitere zelluläre Kinase, PKCeta, identifiziert werden, die NS1 in vitro phosphoryliert und so das virale Polypeptid zusammen mit PKClambda für die rolling circle Replikation stimuliert. Diese Funktion von PKCeta wurde mittels in vivo Analysen bestätigt. Dazu wurde die permissive Maus-Fibroblastenzellinie, A9, stabil mit Flag-Epitop markierten Mutanten transfiziert, die die endogene PKCeta -Aktivität modulieren. Es resultierten A9 Derivat-Zellinien mit konstitutiv aktiver oder Kinase-inaktiver PKCeta. Eine tryptische Phosphopeptid-Analyse von 32P-markiertem NS1 ergab, daß in Gegenwart einer dominant negativen PKCeta-Mutante distinkte Phosphorylierungsereignisse ausblieben. Diese Beobachtung korrelierte mit einer defizienten Synthese an viralen DNA-Replikationsintermediaten der Gesamtzellpopulation im Southern Blotting sowie auf Einzelzellebene mittels BrdU-Inkorporation. Die Ergebnisse belegen damit die Bedeutung der PKCeta -Phosphorylierungen von NS1 für die Stimulierung der parvoviralen Replikation. Interessanterweise löst die MVM-Infektion eine Akkumulierung endogener PKCeta in der nukleären Peripherie aus, was als Zeichen der intrazellulären Aktivierung interpretiert wird. Folgerichtig konnte durch Expression einer Kinase-inaktiven Mutante der PKC-aktivierenden upstream-Kinase PDK-1 diese Translokation von endogener PKCeta nach MVM-Infektion unterbunden werden. Außerdem konnte mittels Fraktionierung gezeigt werden, daß ein Zusammenhang zwischen der PKCeta -Aktivität und der Verteilung der Ezrin Radixin Moesin (ERM) -Proteine in vivo besteht, die mit PKCeta aus einem NS1-aktivierenden zellulären Extrakt über mehrere chromatographische Schritte zusammen aufgereinigt worden waren. Darüberhinaus kolokalisierte Radixin in Immunfluoreszenzanalysen mit den PKCeta-Vollänge-Mutanten an der Plasmamembran. Daraus wurde geschlossen, daß die ERM-Proteine eine Rolle beim Transport von PKCeta zur Plasmamembran spielen könnten. Durch Immunpräzipitation wurde eine spezifische Interaktion zwischen Radixin und der Kinase-inaktiven PKCeta T512A gezeigt, deren funktionelle Relevanz jedoch noch nicht geklärt ist. Da die beobachtete Aktivierung von PKCeta zu Zeitpunkten auftritt, an denen die virale Replikation bereits weit fortgeschritten ist, liegt die Vermutung nahe, daß die Kinase hier möglicherweise weitere, für den viralen Vermehrungszyklus vorteilhafte, Funktionen erfüllt. Es wurde angenommen, daß MVM dieselben Kinase-Aktivitäten, die es zur Initiierung der viralen DNA-Replikation benötigt, auch für die Virus-induzierten morphologischen- und Zytoskelettveränderungen der Wirtszelle ausnutzen könnte. Aus diesem Grund wurden die nach Infektion auftretenden Zytoskelettalterationen anhand von Markerproteinen in der murinen Wirtszelle A9 sowie den Derivaten mit modulierter PKCeta-Aktivität untersucht und miteinander verglichen. So konnten die beobachteten Strukturveränderungen der Wirtszelle erstmals konkret auf Modifikationen der Mikrofilamente sowie Intermediärfilamente zurückgeführt werden. Eine Rolle für PKCeta in diesen Abbau- und Deassemblierungs-vorgängen konnte allerdings nicht gezeigt werden.

Translation of abstract (English)

The multifunctional protein NS1 of the autonomous parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) is posttranslationally modified and at least in part regulated by phosphorylation. Due to its enzymatic functions such as ATPase-, helicase- and nickase-activity NS1 is absolutely essential for viral DNA-replication. Furthermore, NS1 can transregulate promoters and it exhibits cytotoxic effects to the host cell. During replication atypical PKClambda phosphorylates and activates NS1 for helicase-function. This phosphorylation however, is not sufficient to activate the viral protein to drive rolling circle replication in vitro. The data presented here identify an additional cellular kinase, the novel isoform PKCeta, as a regulatory kinase for NS1 functions. PKCeta phosphorylates NS1 in vitro and is able to stimulate the viral polypeptide in concert with PKClambda for rolling circle replication. This property of PKCeta was also verified in vivo generating A9-derivative cell lines with modulated PKCeta-activity. Thereby, the permissive murine fibroblast cell line A9 was stably transfected with Flag- epitope tagged constitutive active or kinase inactive PKCeta mutants. Indeed, in the presence of a dominant negative PKCeta mutant distinct phosphorylation events were underrepresented as determined by a comparative tryptic phosphopeptide analysis of metabolically [32P]- labelled NS1. This observation correlated with deficient synthesis of viral replicative intermediate forms as determined by southern blotting of whole cell populations as well as on the single cell level by means of BrdU- incorporation. Together, these results clearly support the importance of NS1 phosphorylation by PKCeta during parvoviral replication. Interestingly, MVM infection triggers an accumulation of endogenous PKCeta towards the nuclear periphery - a sign for intracellular activation of this protein kinase. In consequence, MVM-induced translocation of PKCeta was inhibited upon expression of a kinase inactive mutant of the upstream activator kinase PDK-1. Furthermore, a correlation between PKCeta activity and the subcellular distribution of the Ezrin-Radixin-Moesin family of proteins (ERM) could be shown using biochemical fractionation. Recently these proteins have been copurified over several chromatography steps together with PKCeta in a NS1-activating cellular fraction. Moreover, in immunofluorescence Radixin colocalized with PKCeta mutants at the plasma membrane. A specific interaction between Radixin and kinase inactive PKCeta T512A could be shown by immunoprecipitation. Its functional relevance, however, is currently unclear. Activation of PKCeta is observed at time-points during infection when viral DNA-replication is already established. Therefore, it can be speculated that PKCeta might also serve other functions such as virus maturation or release of progeny particles apart from activating NS1 for replication. It was assumed that MVM may retarget the same kinases needed for its own activation to induce morphological changes of the host cell. Thus, MVM-induced cytoskeletal alterations of the murine host cell A9 were characterized using marker proteins and compared to the derivatives with modulated PKCeta activity. For the first time the structural changes of the host cell could be defined as a consequence of specific modifications of microfilaments as well as intermediate filaments. However, a role of PKCeta in filament severing and disassembly processes could not be detected.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gerdes, Dr. PD Hans-Herrmann
Date of thesis defense: 28. July 2003
Date Deposited: 18. Aug 2003 10:31
Date: 2003
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Phosphorylierung, Proteinkinase C, Mice minute virus, Replikation
Uncontrolled Keywords: autonomes Parvovirus , Nichtstrukturprotein NS1 , ZytoskelettMinute Virus of Mice , NS1 , replication , phosphorylation , PKC
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