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Identifizierung und Charakterisierung neuer Isotypen des Hüllprotein-Komplexes Coatomer

Wegmann, Dominik Nikolaus

English Title: Identification and Characterization of New Isotypes of the Coat Complex Coatomer

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PDF, German
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Abstract

COPI-Vesikel vermitteln den Transport von Proteinen im frühen sekretorischen Weg. Ihre Proteinhülle besteht aus ARF-GTP und Coatomer, einem heptameren Proteinkomplex. Dieser besteht aus den Untereinheiten a-, b’-, b-, g-, d-, e- und z-COP. Zur Vesikelbildung wird Coatomer in einer bivalenten Interaktion mit ARF-GTP und Oligomeren der p24-Familienmitglieder an die Donormembran rekrutiert. Zu Beginn dieser Arbeit war bereits bekannt, dass eine zweite Isoform von g-COP existiert, die mit g2-COP bezeichnet worden war. Diese Untereinheit wird ubiquitär exprimiert und ist Bestandteil des Coatomer-Komplexes. Ein Coatomer-Komplex enthält jedoch immer nur eine der beiden g-COP-Isoformen. Auch für die Untereinheit z-COP war auf Genebene eine neue z2-Isoform beschrieben worden, deren Transkriptionsprodukte in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde diese neue Untereinheit z2-COP biochemisch und funktionell charakterisiert. Es wurden spezifische Antikörper gegen z2- und z1-COP hergestellt, um zwischen den beiden z-COPs unterscheiden zu können. Mit einem z2-COP spezifischen Antikörper konnte gezeigt werden, dass z2-COP ubiquitär exprimiert wird und Bestandteil des Coatomer-Komplexes ist. Der Anteil von z2-COP am Gesamt-z-COP-Pool im Zytoplasma von Leberzellen wurde auf 20% bestimmt. Durch Immunpräzipitation mit einem z2-COP-spezifischen Antikörper konnte zudem nachgewiesen werden, dass ein Coatomer-Komplex immer nur eine der beiden z-COP-Untereinheiten enthält. Es stellte sich nun die Frage, in welchen Kombinationen die z-COPs mit den beiden g-COP-Untereinheiten vorkommen. Koimmunpräzipitationsstudien ergaben, dass z2-COP ausschließlich mit g1-COP, und z1-COP sowohl mit g1- als auch mit g2-COP in einem Komplex vorkommt. Es wurden somit drei Coatomer-Spezies identifiziert, die durch die Kombinationen z2/g1 (20%), z1/g1 (50%) und z1/g2 (30%) definiert werden. Im klassischen COPI-Vesikel-budding-assay mit Zytosol und gereinigtem Golgi wurde der Einbau von z2-COP in COPI-Vesikel nachgewiesen. Dabei zeigte sich, dass sowohl z1- als auch z2-COP-Coatomer an Golgi Membranen rekrutiert werden, bevorzugt jedoch z1-COP-enthaltender Coatomer in COPI-Vesikel eingebaut wird. Die Coat-Rezeptoren p23, p24 und p25 sind in der Lage, Coatomer zu binden. Für p23 wurde bereits eine direkte Interaktion mit der g-Untereinheit von Coatomer nachgewiesen. Daher wurde die Affinität der zytoplasmatischen Domänen von p24-Familienmitgliedern und Wbp1, einem klassischen Frachtprotein, gegenüber verschiedenen Coatomer-Komplexen untersucht. g2-COP-Coatomer zeigte eine erhöhte Affinität für die p24-Familienmitglieder p23, p24 und p25 verglichen mit g1-COP-Coatomer. Der Effekt war am stärksten ausgeprägt für p24, am schwächsten bei p25. Für das Frachtprotein Wbp1 zeigte sich keine unterschied-liche Affinität gegenüber g1- und g2-COP-Coatomer. Dasselbe Experiment wurde auch in Hinblick auf die z-COP-Untereinheiten durchgeführt. Entsprechend der gefundenen Kombinationen ließ sich der beobachtete Trend mit den z-COPs bestätigen. Schließlich wurde die Lokalisation von z2-COP mit verschiedenen Markern des frühen sekretorischen Weges analysiert. Es zeigte sich, dass es einen z2-Gradienten entlang des frühen sekretorischen Weges gibt. Späte Stationen kolokalisierten schlechter mit z2-COP-markierten Strukturen als frühe. In einer Zelllinie, die stabil HA-getaggtes g2-COP exprimiert, wurde die Lokalisation von z2-COP und g2-COP verglichen. Die biochemischen Daten hatten aufgezeigt, dass z2- und g2-COP nicht zusammen in einem Coatomer-Komplex vorkommen. Auch in der Immunfluoreszenz konnten viele Bereiche identifiziert werden, in denen z2-COP und g2-COP nicht kolokalisierten. Dies deutete nicht nur auf eine konstitutionelle, sondern auch auf eine topologische Differenzierung hin. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Zusammensetzung der Vesikelhülle von COPI-Vesikeln wesentlich komplexer ist als bisher angenommen. Bisher wurde vermutet, dass eine funktionelle Variabilität von COPI-Vesikeln durch Heterooligomere der Rezeptoren für Coatomer, der p24-Familienmitglieder, erzeugt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch eine Varianz des Hüllproteins selbst, die notwendigerweise bei künftigen Modellen zur Funktion von COPI-umhüllten Vesikeln berücksichtigt werden muss. Es bieten sich dadurch auch neue Erklärungsmöglichkeiten für die Befunde, dass COPI-Vesikel im frühen sekretorischen Weg sowohl anterograde als auch retrograde Transportfunktionen übernehmen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Felix
Date of thesis defense: 23 April 2003
Date Deposited: 13 Oct 2003 12:36
Date: 2003
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Coatomer
Uncontrolled Keywords: Isotypen , sekretorischer Weg , Golgi , ER , COPsIsotypes , secretory pathway , COPs , Coatomer
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