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HPV 16 Strukturproteine als Vehikel zur Immunisierung

Guthöhrlein, Heidrun

English Title: HPV 16 proteins as vehicles for immunization

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PDF, German
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Abstract

Bestimmte Typen der humanpathogenen Papillomviren (HPV), z.B. HPV 16, sind ursächlich an der Entstehung von Gebärmutterhalskrebs und seinen Vorläuferläsionen beteiligt. Unter natürlichen Bedingungen erfolgt die Infektion mit HPV in undifferenzierten Epithelzellen des Stratum basale. Jedoch können infektiöse Papillomviren und durch Expression des Hauptstrukturproteins L1 hergestellte virus-ähnliche Partikel (virus-like particles, VLPs), aber auch das „minor“ Strukturprotein L2, an eine Vielzahl von Zellen binden und von diesen aufgenommen werden. Diese Eigenschaft sollte für eine DNA-Immunisierung genutzt werden in der Annahme, daß eine Induktion der Immunantwort effizienter sei, wenn ein Shuttle zum Eintritt der Nukleinsäure in Zellen eingesetzt wird. So könnte eine erhöhte Proteinexpresession in den getroffenen Zellen stattfinden. Die Freisetzung größerer Antigenmengen aus infizierten Zellen wie Muskel- oder Epithelzellen könnte vermehrt zu „cross-priming“ professioneller Antigen-präsentierender Zellen führen und dadurch oder durch direkte Infektion von Zellen des Immunsystems wie Dendritischen Zellen (DCs) die Präsentation des Antigens erhöhen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Strukturproteine L1 und L2 des HPV Typs 16 diese Aufgabe erfüllen können. Zu diesem Zweck sollten drei verschiedene Vehikelpräparationen mit Ovalbumin als Reportergen hergestellt und getestet werden: (i) Pseudovirionen, bei denen die für das Antigen kodierende Reporter-DNA in HPV 16-VLPs verpackt ist, (ii) VLPs, an die das Reportergen von außen chemisch gebunden ist und (iii) ein Peptid von HPV 16 L2, an das das Reportergen gebunden vorliegt. Durch Dis- und Reassembly, bei dem in vitro DNA in VLPs verpackt wird, konnten Pseudovirionen hergestellt werden. Auch die Kopplung des Reportergens an VLPs war erfolgreich. Allein die Bindung zwischen dem HPV 16 L2-Peptid und dem Reportergen konnte nicht nachgewiesen werden. Trotzdem wurden alle Präparationen im Mausmodell auf ihre Immunogenität getestet. Die eingesetzte DNA-Menge pro Maus wurde als Standard gesetzt, um die Effizienz der verschiedenen Vehikelpräparationen vergleichen zu können. In einer intramuskulär (i.m.) durchgeführten DNA-Titration konnte festgestellt werden, daß eine Menge von mindestens 10 µg DNA benötigt wird, um eine meßbare zelluläre Immunantwort zu induzieren. Da die Vehikelpräparationen jedoch das maximale Volumen von 0,05 ml überschritten, das in einer i.m.-Injektion pro Maus eingesetzt werden kann, wurde außerdem die subkutane (s.c.) Route getestet. Bei dieser Applikationsart reichte sogar eine Menge von 100 µg DNA nicht aus, um eine meßbare Immunantwort hervor zu rufen. In der vergleichenden Immunisierung der Shuttle-Vektoren mit nackter DNA erhielt jede Maus über das Vehikel 3 µg DNA, eine Menge, die sich in der i.m. Titration als gerade nicht mehr immunogen erwies. Ein möglicher adjuvanter Effekt der VLPs bei einer Immunisierung mit Ovalbumin war vorher experimentell ausgeschlossen worden. So sollte getestet werden, ob durch Vehikel eingeschleuste DNA immunogener ist als nackte DNA. Eine Zunahme der Immunantwort im Vergleich zu nackter DNA konnte jedoch nicht festgestellt werden. Somit konnte die Hypothese, daß Vehikelpräparationen bestehend aus HPV 16-Strukturproteinen und für Ovalbumin kodierender DNA immunogener sind als nackte DNA, in dieser Arbeit nicht bestätigt werden.

Translation of abstract (English)

Certain types of human pathogenic papillomavirus (HPV), e.g. HPV 16, are causative agents of the development of cervical carcinoma and its precursor lesions. Under natural circumstances, the infection takes place in undifferentiated epithelial cells of the stratum basale. However, infectious papillomavirus and virus-like particles (VLPs) generated by expression of the major structural protein L1 but also the minor structural protein L2 can bind to and are taken up by a wide variety of cells. This capacity should be used for a DNA-immunization, assuming the induction of an immune response would be more efficient when a shuttle is used for entry of the nucleic acid into cells. Thus, a higher protein expression could take place in cells being hit. The release of larger amounts of antigen from infected cells like muscle or epithelial cells could lead to augmented cross priming of professional antigen presenting cells. By this or by direct infection of cells of the immune system such as dendritic cells, the presentation of antigen could be increased. This thesis should analyze whether the structural proteins L1 and L2 of HPV 16 can perform this task. Therefore, three different vehicle preparations with ovalbumin as reporter gene should be generated and tested: (i) pseudovirions where the reporter-DNA coding for the antigen is packaged into HPV 16-VLPs, (ii) VLPs with the reporter gene chemically bound to the outside, and (iii) a peptide of HPV 16 L2 to which the reporter gene is bound. Pseudovirions could be generated by dis- and reassembly where DNA is packaged into VLPs in vitro. Coupling the reporter gene to VLPs was successful as well. Only the bond between the HPV 16 L2 peptide and the reporter gene could not be verified. Nevertheless all preparations should be tested for their immunogenicity in a mouse model. The amount of DNA applied per mouse was set as standards to compare the efficiency of the different vehicles. In an intramuscular (i.m.) DNA-titration was observed that at least 10 µg of DNA are needed to elicit a measurable cellular immune response. Since the vehicle preparations exceed the maximum capacity of 0,05 ml applicable in an i.m. immunization, the subcutaneous (s.c.) route was tested as well. By this way of administration even 100 µg of DNA were not enough to elicit a measurable immune response. In the comparative immunization with the shuttle vectors and naked DNA each mouse received 3 µg DNA via a vehicle, an amount that had been immunogenic no more in the i.m. titration. A potential adjuvant effect of the VLPs in an immunization with ovalbumin had been experimentally excluded beforehand. That way should be tested whether DNA introduced by vehicles is more immunogenic than naked DNA. However, an increase in immune response compared to naked DNA could not be observed. Thus, the hypothesis that vehicles consisting of HPV 16 structural proteins and DNA coding for ovalbumin are more immunogenic than naked DNA could not be confirmed by this work.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gissmann, Dr. Lutz
Date of thesis defense: 14 November 2003
Date Deposited: 19 Nov 2003 10:35
Date: 2003
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Papillomaviren, Immunisierung, DNS
Uncontrolled Keywords: virus-ähnliche Partikel , VLP , HPV 16 , HPV 16 L1 , HPV 16 L2virus-like particles , VLP , HPV 16 , HPV 16 L1 , HPV 16 L2
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