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Rekombinante Antikörper gegen tumorassoziiertes MUC1

Toleikis, Lars

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PDF, German
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Abstract

In Adenokarzinomen wie dem Mammakarzinom wird das tumorassoziierte Antigen MUC1 überexprimiert, dessen extrazelluläre Domäne zum größten Teil aus einem als VNTR (variable number of tandem repeats)-Region bezeichneten Abschnitt besteht. Aufgrund einer im Vergleich zu normalem MUC1 veränderten, weniger starken Glykosylierung der VNTR-Region entstehen in tumorassoziiertem MUC1 neue antigene Determinanten auf Basis der Peptidsequenz und der veränderten Glykosylierung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten aus dem Blut von Mammakarzinom-Patientinnen, die wiederholt mit einem synthetischen MUC1-Glykopeptid der VNTR-Region immunisiert worden waren, rekombinante single chain Fv-Antikörperfragmente (scFv-Fragmente) mit spezifischer Bindung an die VNTR-Region von tumorassoziiertem MUC1 gewonnen werden. Ausgehend von cDNA, die aus den peripheren Lymphozyten von mit einem synthetischen MUC1-Glykopeptid immunisierten Mammakarzinom-Patientinnen gewonnen wurde, konnten mittels PCR die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene amplifiziert werden. Durch Klonierung der VH- und VL-Gene in das Phagemid pSEX81 wurden rekombinante scFv-Antikörpergenbibliotheken hergestellt, die anschließend für eine in vitro-Selektion mit Hilfe des Phagendisplays eingesetzt wurden. Aus einer der generierten Antikörpergenbibliotheken konnte durch ein kombinatorisches Panning auf tumorassoziiertem MUC1 sowie synthetischem MUC1-Glykopeptid der VNTR-Region ein Antikörperklon mit der gewünschten Spezifität isoliert werden. Die für das isolierte Antikörperfragment kodierenden Gene wurden in den Vektor pOPE101 kloniert, um ein lösliches rekombinantes scFv-Fragment im periplasmatischen Raum von E. coli zu exprimieren. Das so produzierte scFv-Fragment IIB6 wurde nach erfolgreicher affinitätschromatographischer Reinigung aus periplasmatischen Extrakten bezüglich seiner Spezifität und Affinität analysiert. In ELISA-Bindungsstudien sowie einem Immunoblot wurde die spezifische Bindung des scFv-Fragments IIB6 an die VNTR-Region von tumorassoziiertem MUC1 belegt, wobei das minimale Epitop des Antikörperfragments die Aminosäuresequenz TRPAP besitzt. Außerdem wurde mit Hilfe einer FACS-Analyse gezeigt, dass das Antikörperfragment IIB6 spezifisch an natives, von Zellen der Mammakarzinom-Zelllinie T47D präsentiertes MUC1 bindet. Die mit Hilfe der Oberflächen-Plasmon-Resonanz ermittelten Affinitäten des generierten scFv-Fragments zu tumorassoziiertem MUC1 und synthetischem MUC1-Glykopeptid betragen 2,75 x 10-7 M bzw. 2,28 x 10-7 M. Das generierte scFv-Fragment IIB6 stellt damit ein potentiell geeignetes Ausgangsprodukt für die Herstellung eines vollständig humanen IgG-Antikörpers oder von Antikörperfusionsproteinen zur Behandlung des Mammakarzinoms sowie anderer MUC1-überexprimierender Adenokarzinome dar.

Translation of abstract (English)

The tumor-associated antigen MUC1 is overexpressed in adenocarcinomas such as breast cancer. The extracellular portion of MUC1 mainly consists of a variable number of tandem repeats (VNTR). In contrast to MUC1 of healthy humans, tumor-associated MUC1 is underglycosylated exposing new peptide and carbohydrate epitopes. In this study single chain Fv antibody fragments (scFv fragments) specific for the VNTR region of tumor-associated MUC1 had to be isolated from breast cancer patients repeatedly vaccinated with synthetic MUC1 glycopeptides representing the VNTR region. CDNA was prepared from peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients vaccinated with synthetic MUC1 glycopeptides and used for PCR amplification of the heavy and light chain variable regions (VH and VL) genes. The VH and VL genes were cloned into the phagemid pSEX81 to generate antibody gene libraries, which were subsequently used for in vitro selection by phage display. An antibody clone of the desired specificity was isolated from one of the generated antibody gene libraries by panning on tumor-derived MUC1 and synthetic MUC1 glycopeptide. The genes encoding the isolated antibody fragment were cloned into the vector pOPE101 for expression of a soluble recombinant scFv fragment in the periplasmic space of E. coli. The produced scFv fragment IIB6 was purified from periplasmic extracts by affinity chromatography, and the specificity and affinity was analysed. The specific binding of the scFv fragment IIB6 to the VNTR region of tumor-associated MUC1 was confirmed by ELISA and immunoblot. The antibody fragment IIB6 recognizes the minimal epitope peptide sequence TRPAP. In addition, it was shown that the antibody fragment IIB6 binds to native MUC1 presented on cells of the breast cancer cell line T47D, as confirmed by flow cytometry. The affinities of the generated scFv fragment to tumor-derived MUC1 and synthetic MUC1 glycopeptide that were determined by surface plasmon resonance are 2,75 x 10-7 M and 2,28 x 10-7 M, respectively. The generated scFv fragment IIB6 is potentially useful for the development of a completely human IgG antibody or antibody fusion proteins for the therapy of breast cancer and other adenocarcinomas overexpressing tumor-associated MUC1.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dübel, Prof. Dr. Stefan
Date of thesis defense: 9 February 2004
Date Deposited: 25 Feb 2004 13:01
Date: 2003
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Universitäts-Frauenklinik
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Tumorantigen, Monoklonaler Antikörper, Antikörper, Antikörperbibliothek
Uncontrolled Keywords: rekombinante Antikörper , MUC1 , scFv
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