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Studien der Genexpressionsänderung während der Entwicklung von Drosophila melanogaster mittels DNA-Microarrays

Beckmann, Boris

English Title: Study of the Gene expression during Development of Drosophila melanogaster with DNA Microarrays

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PDF, German
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Abstract

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist einer der am besten untersuchten Modellorganismen in der Entwicklungsbiologie. Die Kenntnis des Genoms und die Zahl der annotierten protein-kodierenden Gene von Drosophila sind jedoch Schwankungen unterworfen, da sie meist auf Computerberechnungen bereits bekannter Gene und nur teilweise auf experimentellen Nachweisen beruhen. Um das Transkriptom von Drosophila im Verlauf der Entwicklung zu untersuchen und neue potentielle Gene zu identifizieren wurde im Rahmen dieser Arbeit ein DNA-Microarray entwickelt, mit dem Veränderungen in der mRNA-Expression analysiert wurden. Auf der Grundlage einer neuentwickelten ab initio Genvorhersage im Rahmen einer Koorporation wurden spezifische Primer generiert, die eine Amplifikation der potentiellen Gene ermöglichten. Mit einem zweistufigen PCR-Protokoll konnten 20.948 (98%) PCR-Fragmente von 21.396 vorhergesagten Genen amplifiziert werden. Diese wurden als Basis für die Herstellung des Microarrays verwendet. So war es möglich die Vorteile computergestützter in silico- Berechnungen der möglichen Gene mit experimentellen Analysen zu kombinieren, um die Expression von Genen zu detektieren. Durch Optimierung der Protokolle und Methoden in der DNA-Chip-Konstruktion wurde ein hochdichter Microarray hergestellt, der nahezu das gesamte Transkriptom von Drosophila repräsentiert. Die Analyse differentiell exprimierter Gene erfolgte jeweils mit zwei RNA-Populationen die während der reversen Transkription mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und anschließend auf einem Microarray co-hybridisiert wurden. Es wurden Hybridisierungen mit der RNA aus 9 unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Drosophila melanogaster durchgeführt, die den gesamten Lebenszyklus der Fliege umfassten. Nach der Quantifizierung der detektierten Signalintensitäten erfolgte die bioinformatische Datenanalyse mit unterschiedlichen Softwareprogrammen. Die Genexpressionsanalysen ergaben das 13.812 Gene im Verlauf der Entwicklung von Drosophila exprimiert werden, wovon ungefähr 2.500 bisher unbekannten Genen entsprechen. Es konnte außerdem gezeigt werden, daß die Entwicklungsstadien spezifische Regulationen von Genaktivitäten aufweisen, die mit morphologischen Veränderungen während der Entwicklung korrelieren und daß Gengruppen ähnlicher biochemischer oder physiologischer Funktion gemeinsam reguliert werden.

Translation of abstract (English)

The fly Drosophila melanogaster is one of the best known model organism in current Developmental biology. Assuming to know the structure of the genome and the amount of annotated genes coding for proteins based on in silico predictions and partially experimental data only has to be treated with caution since it lacks experimental evidence. To study the gene expression during the development of Drosophila, a new DNA-Microarray, the Heidelberg FlyArray, was developed to identify potential new genes. A novel ab initio gene prediction allowed the generation of 20,948 (98%) amplicons in a two-step PCR-process based on 21,396 specific primer pairs calculated from the genomic sequence of Drosophila. Using these Amplicons for the construction of the microarray, we combined the advantages of in silico gene predictions with an experimental tool to monitor gene expression. By optimising protocols and methods for DNA-chip construction and handling, a high-density microarray was built covering nearly the whole transcriptome of Drosophila. For the analysis of differential expressed genes, total RNA taken from nine stages of Drosophila development, was reverse transcribed and indirect labeled with different Cy3/Cy5-fluorophores. The labeled cDNAs, representing the life cycle of Drosophila were co-hybridised onto the microarray. After detection and quantification of the signals, computational analysis on the data was performed. Using different filtering and statistical bioinformatic methods, we found 13,812 genes expressed throughout the development of Drosophila and identified nearly 2,500 novel genes. The application of various clustering methods on the expressed genes revealed transcriptional profiles of gene regulation specific for the stages and co-regulation of genes with similar function in biochemical pathways and physiology.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sauer, Prof. Frank
Date of thesis defense: 5 February 2004
Date Deposited: 25 Feb 2004 08:23
Date: 2003
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Differentielle Genexpression, Genexpression, Bioinformatik, Microarray, Taufliege
Uncontrolled Keywords: Funktionelle Genomanalysegene expression , microarray , genomics , drosophila
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