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Biochemical purification and functional characterization of the She RNP complex from S. cerevisiae

Jaedicke, Andreas Martin

German Title: Biochemische Aufreinigung und funktionale Charakterisierung des She RNP Komplex aus S. cerevisiae

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Abstract

Asymmetric mRNA localization is a widely used mechanism to sort cell fate determinants in development. In the budding yeast Saccharomyces cerevisae ASH1 (for 'asymmetric synthesis of HO') mRNA localization to the tip of the growing bud leads to targeting of Ash1p to the daughter cell nucleus prior to cytokinesis and is a prerequisite for proper mating type switching. In a genetic screen 5 SHE (for 'Swi5p-dependent HO expression') genes have been isolated, coding for proteins required for the RNA localization process. SHE1 is equivalent to MYO4, a locus that encodes a member of the class V unconventional myosins. The finding that a motor protein is required for ASH1 mRNA targeting suggested a cytoskeleton-based, active transport mechanism. Functional characterization of the SHE genes in turn established a working model for the 'core She machinery' which implies She1p / Myo4p as the ATP-dependent motor protein, She2p as the ASH1 mRNA-binding protein, and She3p as adapter protein connecting She2p to She1p / Myo4p. She4p has been suggested to function in myosin assembly, whereas She5p is required for cell cycle regulated remodeling of the actin cytoskeleton. In a shared project with C. Kruse we could show that Myo4p trafficking is regulated by the formation of a robust She RNP, and relies on She2p and RNA association. In addition to the She proteins, accessory factors such as Loc1p or Khd1p have been suggested to function in ASH1 mRNA localization though they have not been identified in the genetic screen. Thus, in order to allow a detailed characterization of the ASH1-She RNP ('ribo-nucleoprotein') complex, I initiated a biochemical purification. In order to enrich for the She RNP two myo4p mutants were generated in the myosin ATPase, a domain required for Myo4p force generation. Localization studies reveal that the mutants do not transport ASH1 mRNA anymore to the bud tip but instead accumulate in an intermediate, 'frozen' state in the cytoplasm. Affinity purification was carried out based on the TAP ('tandem affinity purification') protocol, using two alternative bait proteins (She2-TAP or Myo4-TAP). In either case I could purify the core She machinery together with ASH1 mRNA. Further analysis of the She RNP by gel filtration experiments revealed a peak fraction with a molecular weight of approximately 4.5 MDa. Within this fraction I could identify Myo4p, She2p and ASH1 mRNA, arguing for the integrity of a single RNP. In addition to She1-3p mass-spectrometric analysis identified a number of so far unknown proteins, including the kinase Gin4p and the translation inhibitor Eap1p. Eap1p has been of outstanding interest since a systematic RNA localization assay with ash1 mutants that contained premature stop codons inserted at various positions within the coding sequence have revealed severe localization defects, indicating that translation (and translational regulation) is required for correct localization. Eap1p has been characterized as an inhibitor of translation initiation and belongs to the family of 'eukaryotic initiation factor 4E-binding proteins', eIF 4E-BPs. Members of this protein family share a common sequence motif which mediates association with eIF 4E, thereby blocking initiation of translation. Initial studies with D eap1 yeast strains have revealed a defective partial accumulation of Ash1p in mother cell nuclei, whereas ASH1 mRNA localization to the bud tip and total Ash1p levels remained unaffected. This observation prompted me to introduce a new model for ASH1 mRNA localization, including the regulation of translation initiation during cytoplasmic She RNP trafficking to the bud.

Translation of abstract (German)

Die spezifische Lokalisierung von mRNAs sowie eine sich daraus ableitende räumlich begrenzte Protein-Expression stellt einen häufig genutzten Mechanismus zur Generierung von Zell-Asymmetrie dar. In sich teilenden Zellen der Sproß-Hefe S. cerevisiae wird in einem aktiven Transportmechanismus entlang von Zytoskelett-Strukturen ASH1 ('asymmetric synthesis of HO') mRNA an die Spitze der wachsenden Knospe lokalisiert. Die dadurch auf die Tochterzelle begrenzte Expression von Ash1p, eines Transkriptions-Repressors, ermöglicht die Akkumulation des Repressors ausschliesslich im Tochter-Zellkern und dadurch eine differenzielle Genexpression von Mutter- und Tochterzelle. Ein genetischer 'screen' für Faktoren, die zur Anreicherung von Ash1p im Tochter-Zellkern benötigt werden, identifizierte 5 She ('Swi5p-dependent HO expression') Proteine, She1-5. Es stellte sich heraus, daß She1p identisch zu Myo4p ist, einem Klasse V Myosin Motor-Protein. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass She2p direkt an ASH1 mRNA bindet, und durch She3p mit dem Myo4p Motor-Protein verknüpft wird. Die Analyse des ASH1 Lokalisations Mechanismus ergab, dass die mRNA als Teil des She RNP ('Ribo-Nukleoprotein') Komplexes und in Assoziation mit She1-3 an die Tochterzell-Spitze transportiert wird. In einem gemeinsamem Forschungs-Projekt mit C. Kruse zur Untersuchung der Regulation dieses Myo4p-abhängigen Prozesses konnte gezeigt werden, dass der She RNP Transport in Richtung Tochterzell-Spitze von der Assoziation mit einer RNA als Fracht abängig ist. Berichte über die Entdeckung zusätzlicher Faktoren, die ähnlich wie die She Proteine am ASH1 mRNA Lokalisations-Prozeß beteiligt sein sollen (Khd1p, Loc1p), ließen darauf schließen, daß in dem ursprünglichen genetischen 'screen' nicht sämtliche Faktoren isoliert werden konnten. Die Zielsetzung meiner Doktorarbeit war somit die biochemische Aufreinigung des She RNPs, sowie die Charakterisierung möglicher neuer, She-ähnlicher Faktoren. Zur Isolierung des She RNP entwickelte ich ein auf dem Prinzip der TAP ('tandem affinity purification') basierendes Versuchs-Protokoll. Mit Hilfe von myo4p Mutanten, die den Transport, nicht jedoch die Formation des RNPs blockieren, konnte ich das Ausgangsmaterial für die Aufreinigung anreichern. Die Analyse des isolierten She RNP ergab die Identifizierung der She Proteine She2p, She3p, sowie Myo4p und ASH1 mRNA. Zusätzlich zu den She Proteinen wurden einige bisher unbekannte Faktoren gefunden, darunter der Translations Repressor Eap1p und die Protein Kinase Gin4p. Mittels Gelfiltration wurde die Größe des She RNP auf etwa 4.5 MDa bestimmt. Die weiterführende Analyse der Säulenfraktionen ergab den Nachweis der She Proteine sowie der ASH1 mRNA in einem einzigen 'peak', ein Hinweis, daß die gefundenen Faktoren Komponenten eines einzigen, intakten Komplexes sind. Da frühere Experimente gezeigt hatten, daß die Insertion eines Translations Stop Codons in den codierenden Bereich der ASH1 mRNA zu einer Reduzierung der Lokalisierungs-Effizienz führt, folgerte ich, daß die Lokalisation translations-abhängig ist. Aus diesem Grund wählte ich Eap1p zur einführenden Charakterisierung bezüglich einer möglichen Funktion als ASH1 Translations Repressor. In D eap1 Mutanten konnte gezeigt werden, daß Ash1p partiell in Mutter-Zellkernen akkumuliert, wohingegen die Anreicherung der RNA an der Tochterzell-Spitze sowie die zelluläre Ash1p Gesamt-Proteinmenge von der Mutation nicht betroffen sind. In einem Modell verknüpfe ich den zytoplasmatischen She RNP Transport mit einer postulierten Rolle von Eap1p als ASH1 Translations Repressor.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jansen, Professor Ralf-Peter
Date of thesis defense: 6 May 2004
Date Deposited: 11 May 2004 11:11
Date: 2004
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Nichtmuskuläres Myosin, Paarungstyp
Uncontrolled Keywords: mRNS Lokalisation , Translationskontrolle , RNP Komplextandem affinity purification , ASH1 mRNA
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