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Funktionelle Charakterisierung der humanen Polo-Kinase Plk2/Snk im Zell- und Centrosomenzyklus

Warnke, Silke

English Title: Functional Characterisation of the human Polo-like Kinase Plk2/Snk in Cell cycle and Centrosome cycle

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PDF, German
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Abstract

In den letzten Jahren wurden viele neue Familien von Proteinkinasen beschrieben, die neben den Cyclin-abhängigen Kinasen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellzyklus spielen. Die funktionelle Charakterisierung dieser Proteine trägt entscheidend dazu bei, die komplexe Regulation des Zellzyklus sowie die Entstehung von Krebs zu verstehen. Polo-Kinasen sind eine kürzlich beschriebene, neue Proteinfamilie deren Mitglieder an der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind. Die bislang am besten untersuchte humane Polo-Kinase ist Plk1, welche wichtige mitotische Prozesse reguliert. Dagegen sind die Funktionen der anderen Polo-Kinasen Plk2, Plk3 und Plk4 noch nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Arbeit war daher es, die Funktion der humanen Polo-Kinase Plk2 zu charakterisieren sowie Substrate von Plk2 zu identifizieren. Dazu wurde die Aktivität und die Expression von Plk2 in Zeitkurven mit HeLa-Zellextrakten nach Synchronisation in der Mitose bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Plk2-Aktivität in HeLa-Zellen in der späten G1-Phase ansteigt und ihr Maximum am G1/S-Übergang erreicht, etwa zum gleichen Zeitpunkt der Aktivierung der Cyclin E/Cdk2-Kinase. Da der Proteingehalt von Plk2 während der gesamten Zeit konstant ist, wird Plk2 wahrscheinlich in jeder G1-Phase durch einen post-translationalen Mechanismus aktiviert. Weiterhin wurde die Aktivität in humanen Fibroblasten am G0/S-Übergang untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Plk2 bereits nach dem Wiedereintritt in den Zellzyklus aktiviert wird und die Aktivität in der Mitte der G1-Phase wieder absinkt. Diese Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Plk2 am G0/S-Übergang sowie auch am G1/S-Übergang hin. Zur weiteren Untersuchung der in vivo Funktion von Plk2, wurde das Plk2-Protein durch Mikroinjektion mit spezifischen Antikörpern gegen Plk2 ausgeschaltet und durch RNA-Interferenz herunterreguliert. Sowohl die Mikroinjektion der Antikörper als auch die Herunter- regulation durch RNA-Interferenz führen zu einem Arrest der Zellen in der G1-Phase. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Duplikation der Centriolen durch RNA-Interferenz sowie durch Überexpression der kinase-inaktiven Mutante Plk2-K111R in Zellen blockiert wird. Diese Resultate zeigen, dass Plk2 die erste Polo-Kinase ist, die sowohl am G1/S-Übergang als auch an der Centriolen-Duplikation beteiligt ist. Mit Hilfe des Zwei-Hybrid-Screens in Hefe konnte c-Myb, ein Transkriptionsfaktor der hauptsächlich in hämatopoietischen Zellen exprimiert wird, als Substrat für Plk2 am G1/S-Übergang identifiziert werden. Da die Plk2-Kinase ebenfalls in hämatopoietischen Zellen exprimiert wird, könnte sie die transkriptionelle Aktivität von c-Myb nach Stimulation der Zellen mit Zytokinen regulieren. Plk2 interagiert sowohl in vivo als auch in vitro mit c-Myb. Dabei bindet Plk2 und phosphoryliert die regulatorische Domäne am carboxy-terminalen Ende von c-Myb. Plk2 könnte somit die transkriptionelle Aktivität von c-Myb regulieren und dadurch das Wachstums von hämatopoietischen Zellen beeinflussen.

Translation of abstract (English)

To ensure genomic stability the cell cycle needs to be tightly regulated. Polo-like kinases comprise a new family of Ser/Thr kinases that structurally distinct from cyclin-dependent kinases (Cdk) and play important roles in cell cycle control mechanisms. Of these, Plk1 is the best characterised polo-like kinase family member and clearly functions during M phase. The function of Plk2, Plk3 and Plk4 remains less clear. The aim of this work was to functionally characterize human Plk2 during cell cycle progression. Time course experiments in HeLa cells establish that Plk2 protein levels are constant during cell cycle progression but the kinase activity is activated by a post-translational mechanism in late G1 at the same time as Cyclin E/Cdk2 is activated. This suggests a role for Plk2 at the G1-to-S-phase transition. Furthermore, in serum starvation and release experiments Plk2 activity was activated directly after addition of serum in human fibroblasts (Hs68). These results also indicate that Plk2 functions during progression from G0 to S phase. To further investigate the function of Plk2 the protein was ablated (1) by microinjection of specific antibodies against Plk2 into human fibroblasts synchronized in G1 and (2) by RNA interference. Suppression of the Plk2 function by microinjection as well as by RNA interference causes a delay in S-phase entry suggesting that Plk2 is essential for the G1-to-S-phase transition. The observed block in G1 might be a consequence of blocking the initiation of centrosome duplication in these cells because suppression of Plk2 funktion by RNA interference prevents centrosome reduplication. Furthermore, following inhibition of Plk2 function by overexpressing the kinase inactive mutant Plk2-K111R results in failure of centriole duplication during the cell cycle in human fibroblasts. Taken together, the results presented herein reveal that Plk2 (1) is rate-limiting for progression from quiescence to S-phase in human fibroblasts and (2) is required for G1-to-S-phase transition due to regulation of centriole duplication in cells. Using a yeast two-hybrid screen, c-Myb was identified as a substrate of the Plk2 kinase. Since both Plk2 and c-Myb are expressed in hematopoietic cells, Plk2 may be a likely candidate to regulate c-Myb activity. The results further demonstrate that Plk2 can physically interact with c-Myb in vivo and in vitro. In addition, Plk2 phosphorylates the carboxy-terminal part of c-Myb in vitro. These results define a novel signal transduction cascade involving Plk2 and c-Myb, and suggest a role for both proteins in cytokine-regulated control of hematopoietic cell proliferation.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hoffmann, Dr. Priv.- Ingrid
Date of thesis defense: 11 May 2004
Date Deposited: 19 May 2004 11:52
Date: 2004
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Zellzyklus
Uncontrolled Keywords: Polo-Kinase , Plk2 , Centrosomen-VerdopplungPolo-like kinase , Plk2 , centriole duplication
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