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Charakterisierung einer Hüllprotein-vermittelten Restriktion von HIV-2 in humanen Zellen

Reuter, Sandra

English Title: Characterisation of an envelope mediated restriction of HIV-2 in human cells

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PDF, German
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Abstract

Die Erforschung von Restriktionen der HIV-Infektion spielt eine wichtige Rolle für die Aufklärung und das Verständnis von Virus-Wirt-Interaktionen und liefert neue Ansätze für die Entwicklung antiviraler Therapien. In der vorliegenden Arbeit wurde die Restriktion eines HIV-2 Isolates in humanen Zellen analysiert. Das Primärisolat prCBL23 erfährt im Vergleich zum T-Zell-adaptierten Isolat CBL23 eine Restriktion der Infektion in einigen humanen Zelllinien und primären Zellen. Die restriktiven Zellen exprimieren dabei die für die HIV-Infektion notwendigen Rezeptoren CD4 und CXCR4 und teilen sich aktiv. Zunächst wurde eine virale Determinante der Restriktion charakterisiert, dann die Phase des Replikationszyklus bestimmt, in der sich die Restriktion manifestiert, und anschließend Versuche zur Aufklärung des Mechanismus der Restriktion durchgeführt. In Infektionsstudien mit pseudotypisierten HIV-2-Partikeln konnte gezeigt werden, dass das Hüllprotein von prCBL23 die virale Determinante der Restriktion in GHOST/X4-Zellen ist. Es vermittelt im Vergleich zum Hüllprotein von CBL23 eine 60fache Restriktion der Infektion. Durch Mutationsanalyse der Hüllproteine prCBL23-Env und CBL23-Env konnte gezeigt werden, dass die Aminosäure an Position 74 im aminoterminalen Bereich von prCBL23-Env die für die Restriktion kritische Determinante ist. Die Aminosäure an Position 111 und die Verkürzung der zytoplasmatischen Domäne von prCBL23 spielen nur eine untergeordnete Rolle. Durch die Quantifizierung der Hüllproteine in den pseudotypisierten Partikeln konnte ausgeschlossen werden, dass die Restriktion durch einen schlechten Einbau des Hüllproteins in das virale Partikel vermittelt wird. Mit Hilfe des BlaM-Assays konnte gezeigt werden, dass die restringierten prCBL23-Env-Partikel mit ähnlicher Effizienz mit GHOST/X4-Zellen fusionieren können wie die nicht-restringierten CBL23-Partikel. Dies bedeutet, dass die Restriktion erst nach der Fusion innerhalb der Zelle stattfindet. Eine Analyse der viralen DNA in GHOST/X4-Zellen durch quantitative PCR zeigte weiterhin, dass sich die Restriktion bereits vor oder während der reversen Transkription manifestiert. Dies wirft die Frage auf, wie das Hüllprotein Prozesse beeinflussen kann, die nach der Fusion innerhalb der Zelle stattfinden. In Infektionsstudien mit gemischten Partikeln konnte beobachtet werden, dass bereits wenig CBL23-Env in prCBL23-Partikeln die Restriktion drastisch reduziert. Andererseits konnten keine Hinweise gefunden werden, dass die Aktivierung von Signalkaskaden eine Rolle für die Vermeidung der Restriktion spielt. Dies könnte bedeuten, dass die Restriktion nur vermieden werden kann, wenn CBL23-Env die Fusion selbst vermittelt. Eine Hypothese für den der Restriktion zugrunde liegenden Mechanismus wäre, dass durch die kritische Aminosäureposition 74 die Interaktion des Hüllproteins mit zellulären Oberflächenmolekülen beeinflusst wird, so dass die beiden Hüllproteine, möglicherweise unter Ausnutzung spezieller Mikrodomänen in der Zellmembran, das virale Kapsid auf verschiedenen Routen in die Zelle schleusen, die unterschiedlich günstige Bedingungen für die Replikation bieten. So könnten prCBL23-Env-Partikel in einem zellulären Kompartiment festsitzen, das keine günstigen Bedingungen bietet, oder die Degradation fördert. Die weiterführende Aufklärung des Mechanismus der Restriktion kann maßgeblich zu einem detaillierten Verständnis von Post-Fusions-Ereignissen wie Uncoating, Zusammenlagerung des Präintegrationskomplexes und Start der reversen Transkriptase beitragen, die bislang nur unzureichend erforscht sind.

Translation of abstract (English)

The investigation of restrictions to HIV replication are very import for the elucidation and understanding of virus-host interactions and may provide new targets for the development of antiviral therapies. In this thesis, the restriction of an HIV-2 isolate to infection of human cells has been analysed. In comparison to the T-cell line adapted isolate CBL23, the primary isolate prCBL23 is unable to infect some human cell lines and primary human cells, although the restrictive cell types express the HIV- receptors CD4 and CXCR4. First, the viral determinant of the restriction has been characterised, then the step of the replication cycle at which the restriction manifests has been determined. Finally, experiments towards the elucidation of the mechanism of restriction have been performed. Infection studies with pseudotyped HIV-2 particles revealed that the envelope protein of prCBL23 is the viral determinant of the restriction in GHOST/X4 cells. It confers a 60fold restriction to infection compared to the envelope protein of CBL23. The mutational analysis of both prCBL23-Env and CBL23-Env mapped the critical determinant of the restriction to amino acid 74 in the aminoterminal region of prCBL23. Amino acid 111 and the truncation of the cytoplasmic domain of prCBL23-Env play only secondary roles. The quantification of the amount of envelope protein in the investigated pseudotype particles excluded the possibility that the restriction is mediated by inefficient incorporation of the envelope protein into viral particles. The investigation of the entry efficiency with a BlaM-Assay showed that the restricted prCBL23-Env particles and the non-restricted CBL23-Env particles mediate fusion with similar efficiency. Therefore, the restriction to infection manifests after fusion within the cell. Furthermore, the analysis of viral DNA in GHOST/X4 cells by quantitative PCR revealed that the restriction to infection manifests before or during reverse transcription. This raises the question how the envelope protein is able to influence post-entry events of the viral replication. Infection studies with mixed particles showed that already minor amounts of CBL23-Env in prCBL23 particles dramatically reduce their restriction to infection. However, no evidence could be found that the activation of signalling cascades is involved in restriction of prCBL23 particles. A hypothesis for the mechanism of restriction is that the critical amino acid 74 influences the interaction of the envelope protein with cellular surface molecules. Thereby, the envelope proteins might target the viral capsid into different cellular compartments that provide different conditions for the viral replication. prCBL23-Env particles might be trapped in a compartment that does not promote replication or that accelerates degradation. The further elucidation of the mechanism of restriction will contribute to the understanding of post-fusion events in the HIV life cycle like uncoating, assembly of the preintegration complex or initiation of reverse transcription.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kräusslich, Prof. Dr. Hans-Georg
Date of thesis defense: 13 May 2004
Date Deposited: 05 Jul 2004 15:00
Date: 2004
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Hygiene-Institut
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: HIV, HIV-Infektion
Uncontrolled Keywords: Restriktionsfaktorenrestriction factors
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