English Title: Establishment of an inducible autochthonous hepatocarcinoma model

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte ein Mausmodell für ein induzierbares, autochthones Hepatokarzinom etabliert werden. Dabei erfolgt die Tumorentwicklung im Gegensatz zu transplan-tierten Tumoren, die ektopisch wachsen, autochthon, also im betroffenen Organ selbst. Durch die induzierbare Expression eines Onkogens kann die Tumorbildung nur auf einen kleinen Teil der Zellen dieses Organes im erwachsenen transgenen Tier begrenzt werden. Damit wird die unphysiologische Situation herkömmlicher Onkogen-transgener Modelle vermieden, in denen alle Zellen des betroffenen Organes in einer frühen Entwicklungsphase des Tieres transformieren können. Induzierbare, autochthone Tumor-Modelle kommen daher der sporadischen Tumorentstehung im Menschen nahe und sind deshalb essentiell für die Evaluierung von Vakzinierungsstrategien und therapeutischen Ansätzen, die auf einer Akti-vierung des Immunsystems beruhen. Zu Beginn der Arbeit stand eine Reihe von transgenen Mauslinien zur Verfügung, die das SV40 T Antigen (TAg) unter der Kontrolle des Albumin-Promotor/Enhancers exprimieren. Die Induktion der Onkogen-Expression sollte mit Hilfe der Cre-Rekombinase entweder durch Inversion einer mit loxP-Sequenzen flankierten, invertierten TAg-Sequenz (ATI Linien) oder durch Deletion einer loxP-flankierten Stopp-Kassette (AST Linie) erreicht werden. Durch Kreuzung dieser Linien mit cre-deleter Tieren, die Cre in der Keimbahn exprimieren, wurde zunächst diejenige Linie identifiziert, ·die nach Cre-Rekombination in allen Tieren ausschließlich Lebertumoren bildete, ·bei der sich die hepatozellulären Karzinome mit gleichmäßigem Verlauf innerhalb ei-nes experimentell sinnvollen Zeitraums von 2 bis 3 Monaten entwickelten, und ·bei der in keinem der unrekombinierten Tiere eine Tumorbildung festzustellen war. Nur die AST Linie erfüllte diese Kriterien und wurde daher für die folgenden Induktionsversuche eingesetzt. Um die Onkogen-Expression in erwachsenen AST Tieren kontrolliert induzieren zu können, wurden Cre-kodierende Plasmide verpackt in Liposomen oder komplexiert mit polykationischen Reagenzien und Cre-Adenoviren benutzt. Die Effizienz der Rekombination wurde zu-nächst in Reportermäusen getestet, die nach Cre-Rekombination entweder Grün-fluoreszierendes-Protein oder beta�Galaktosidase exprimieren. Cre-Plasmide führten nur unzu-verlässig zur Rekombination in der Leber von Reportermäusen. Auch in AST Tieren konnten mit dieser Methode keine Tumoren induziert werden. Dagegen konnte durch Injektion von Cre-Adenoviren, eine dosisabhängige Transduktion von Hepatozyten, eine Rekombination und eine daraus resultierende Tumorbildung in AST Tieren erzielt werden. In anderen Orga-nen konnte keine Transformation festgestellt werden. Aus den Toleranzstudien der Arbeitsgruppe war bekannt, das geringste Mengen eines Transgenproduktes, die durch RT-PCR kaum nachzuweisen waren, bereits zu T Zelltoleranz in vivo führen konnten. Es war daher wichtig, den Immunstatus der unrekombinierten AST Tiere zu charakterisieren. Dafür standen T Zellrezeptor (TZR)-transgene Mäuse zur Verfü-gung, die TAg Peptide präsentiert von Haupthistokompatibilitätskomplex-Antigenen der Klasse I bzw. II durch CD8 (TG-B) bzw. CD4 (TAgTCR1) T Zellen erkennen können. Leichte phänotypische Veränderungen in den transgenen T Zellpopulationen von (ASTxTG-B) F1 und (ASTxTAgTCR1) F1 Tieren im Vergleich zu den jeweiligen TZR einzel-transgenen Tie-ren deuteten auf einen Kontakt mit dem Selbst-Antigen TAg hin. Allerdings konnte weder auf mRNA-Ebene noch auf Proteinebene TAg-Expression nachgewiesen werden. In vitro konnten sowohl Zellen aus (ASTxTG�B) F1 als auch (ASTxTAgTCR1) F1 Tieren ebenso wie Zel-len aus TZR einzel-transgenen Tieren durch ihr spezifisches Peptid zur Proliferation angeregt werden. Im Gegensatz hierzu wurde ein Transplantationstumor in TAgTCR1 Tieren abgestoßen, während AST und (ASTxTAgTCR1) F1 Tiere tolerant gegenüber diesem Tumor waren. Durch Immunisierung von (ASTxTAgTCR1) F1 Tieren vor Tumorapplikation konnte diese Toleranz zum Teil gebrochen werden, da das Tumorwachstum deutlich inhibiert war. Die Situation im AST-Modell � Toleranz in vivo trotz Reaktivität in vitro � spiegelt sich auch im Menschen wider. In Tumorpatienten können Tumor-spezifische T Zellen nachgewiesen werden, die in vitro Reaktivität gegenüber ihrem Antigen zeigen. Dennoch können sie in vivo den Tumor nicht abstoßen. Das AST-Modell ist daher sehr gut für Studien geeignet, wie Toleranz in vivo gegen ein Tumor-Antigen gebrochen werden kann, um das Immunsystem zu einer Anti-Tumorantwort auch gegen den autochthon wachsenden Lebertumor anzuregen.

Translation of abstract (English)

The aim of this study was to establish an inducible mouse model for the development of autochthonous hepatocarcinoma. In such a model tumor development occurs autochtho-nous, i.e. in the respective organ itself, in contrast to transplantation tumors that grow ectopi-cally. Inducible oncogene expression only allows transformation in a limited number of cells in the targeted organ of an adult transgenic animal. This circumvents the unphysiological situation of conventional oncogene transgenic mice, where all cells of the respective organ are able to transform early in the development of this animal. Inducible autochthonous tumor models can mimic the sporadic tumor formation in humans and are, thus, indispensable for the evaluation of vaccination strategies or therapeutic approaches, which rely on the activa-tion of the immune system. At the beginning of this research project, transgenic mouse lines were available in which SV40 T antigen expression is controlled by the albumin-promotor/enhancer. With the help of cre�recombinase, oncogene expression can be induced either by inversion of the antisense TAg sequence flanked by loxP sequences (ATI lines) or the deletion of a loxP-flanked stop-cassette (AST line). These mice were crossed to cre-deleter mice, which express cre in the germline, to identify any transgenic line that has the following features: ·exclusive development of liver tumors after cre recombination, ·formation of a homogenous hepatocellular carcinoma within a reasonable experimen-tal time frame of 2 to 3 months ·a lack of tumor development in unrecombined AST mice. Only the AST line fulfilled these criteria and was used for the following induction experiments. To control oncogene expression in adult AST mice, cre-encoding plasmids - enveloped in liposomes or complexed with polycationic substances - or cre adenoviruses, were used. First, recombination efficiency was analyzed in reporter mice, expressing enhanced green fluorescent protein or b-galactosidase after cre recombination. However, cre plasmids gave unreliable recombination in the livers of reporter mice. In contrast, injection of cre adenovirus resulted in transduction, recombination and therefore tumor formation in AST mice. Further-more, no transformation was observed in other organs. Previous tolerance studies in our research group revealed that minute amounts of a trans-genic product � undetectable even by RT-PCR technology -- already induce T cell tolerance in vivo. Therefore, it was important to characterize the immune status of unrecombined AST mice. To do this, T cell receptor (TCR) transgenic mice that recognize TAg peptides pre-sented by major histocompatibility complex molecules class I or class II to CD8 (TG-B) or CD4 (TAgTCR1) T cells were used. Minor differences between transgenic T cell populations from (ASTxTG-B) F1 and (ASTxTAgTCR1) F1 mice were detectable in comparison to the respective single transgenic TCR mice, indicating encounter with the self antigen TAg had occurred. In vitro transgenic T cells from both (ASTxTG-B) F1 and (ASTxTAgTCR1) F1 mice did proliferate in response to their cognate peptide to the same extent as transgenic T cells from single transgenic TCR mice. In contrast, TAgTCR1 mice rejected a transplantation tu-mor, whereas AST and (ASTxTAgTCR1) F1 mice were tolerant towards this tumor. Immuni-zation of (ASTxTAgTCR1) F1 mice before tumor application resulted in partial breaking of tolerance, since tumor growth was clearly inhibited. This situation seen in the AST model of in vivo tolerance despite in vitro reactivity is mirrored in humans, too. Tumor specific T cells recognizing their antigen in vitro can be isolated from cancer patients. However, these tumors are not rejected in vivo. In conclusion, the AST model is a useful tool to perform studies on how to break tolerance against a tumor antigen in vivo to elicit tumor immunity against an autochthonous growing liver tumor.