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Metallkomplex-funktionalisierte Oligonucleotide und Peptidnucleinsäuren für die DNA-Sequenzerkennung

Brunner, Jens

English Title: Metal coplex functionalised oligonucleotides and peptide nucleic acids for DNA sequence detection

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PDF, German
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Abstract

Die Arbeit umfasst die Synthese Metallkomplex-funktionalisierter Oligonucleotide und Peptidnucleinsäuren und deren Anwendung als Sonden für den sequenzspezifischen DNA-Nachweis. Die Ligation chemisch modifizierter Oligonucleotide (bzw. deren Analoga) am Nucleinsäure-Templat ist ein etabliertes Detektionsverfahren mit hoher Sequenzselektivität, aber geringer Sensitivität aufgrund starker Produkthemmung. Durch Entwicklung einer katalytischen Variante der templatgesteuerten Reaktion konnte die Sensitivität des Verfahrens durch Signalamplifikation gesteigert werden. Dazu wurden terminale Esterkonjugate (Substrate) und Metallkomplexkonjugate (Katalysatoren) von Peptidnucleinsäuren (PNAs) synthetisiert. Die Ester-PNA und die Metallkomplex-PNA wurden am komplementären DNA-Templat in räumliche Nähe gebracht, wodurch die metallkatalysierte Spaltung des Esters stark beschleunigt wurde. Durch den Templateffekt wurde eine Reaktionsbeschleunigung um den Faktor 150 gegenüber der Hintergrundreaktion erzielt. Bei 100fachem Esterkonjugat-Überschuss konnten 35 Umsätze erreicht werden. Eine Fehlbasenpaarung der komplementären DNA erniedrigte die Reaktionsgeschwindigkeit bis zu 15fach. �Molecular Beacons� (Molekulare Leuchtfeuer) sind Oligonucleotid-Sonden mit Haarnadelstruktur, die bei Hybridisierung fluoreszieren, da eine intramolekulare Fluorophor-Quencher-Wechselwirkung unterbunden wird. Im Rahmen der Arbeit wurden �Molecular Beacons� entwickelt, in denen ein Metallkomplex durch koordinative Bindung an den Fluorophor als fluoreszenzlöschende Komponente wirkt. Dazu wurden 3´-Fluorescein und 5´-Ligand modifizierte DNA-Oligonucleotide mit Haarnadelstruktur synthetisiert. Im nicht-hybridisierten Zustand ist die Fluoreszenz der Kupfer(II)-komplexierten Oligonucleotid-Sonden effektiv gelöscht. Durch Hybridisierung mit komplementärer DNA wurde der Metallkomplex vom Farbstoff räumlich getrennt. Dadurch konnte eine 14fache Erhöhung der Fluoreszenz und eine Diskriminierung einer einzelnen Fehlbase um den Faktor 40 erzielt werden. Das Potential dieses neuen Sondentyps liegt in der Möglichkeit, die Stärke der Fluorophor-Quencher-Wechselwirkung abzustimmen, und damit die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren und unspezifische, störende Wechselwirkungen zu blockieren.

Translation of abstract (English)

This study entails the syntheses of metal complex functionalized oligonucleotides and peptide nucleic acids and their application in DNA sequence detection. Ligation reactions of chemically modified oligonucleotides (or their analogues) on DNA templates are widely used for DNA detection with high sequence selectivity but only little sensitivity due to product inhibition. Signal amplification of a DNA templated catalytic reaction can increase the sensitivity. For that purpose terminal ester conjugates and metal complex conjugates of peptide nucleic acids were synthesized. A DNA template brought ester PNA and metal complex PNA in close proximity and enabled therefore metal catalysed ester cleavage reaction. The template effect of complementary DNA increased the reaction rate 150 times. With 100 times excess of ester substrate, 35 turnovers could be observed. A single mismatch reduced the reaction rate up to 15 times. �Molecular beacons� are oligonucleotides with hairpin structure. They fluoresce upon hybridization to complementary DNA, due to elimination of intramolecular fluorophore quencher interaction. In this work metal quenched �molecular beacons� were developped in which a fluorophore is quenched by coordinative interaction with a metal complex. 3´-fluorescein and 5´-ligand modified DNA oligonucleotides with hairpin structure were synthesized. Without complementary DNA fluorescence is efficiently quenched. After hybridization, the metal complex was spatially separated from the fluorophore by the rigid DNA duplex, and a 14-fold increase of fluorescence could be observed. Complementary DNA increased the fluorescence 40-fold compared to DNA with a single mismatch base pair. The advantage of this kind of detection reagent can be the possibility to tune the fluorophore quencher interaction to get lower background signal and to eliminate unspecific interactions.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krämer, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 26. November 2004
Date Deposited: 01. Dec 2004 14:08
Date: 2004
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: DNS, Molecular Beacons, Chemische Reaktion / Katalyse, Peptid-Nucleinsäuren
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