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Biochemische Charakterisierung und physiologische Bedeutung eines neuen durch Typ I Interferon induzierten Gens

Klehr, Markus

English Title: Biochemical characterisation and physiological importance of a novel gene induced by type I Interferon

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PDF, German
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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Struktur, Expression und Regulation des Interferon-regulierten-Gens-28 (IFRG28) untersucht und das Protein anhand von selbst hergestellten monoklonalen Antikörpern und stabil-transfizierten Zelllinien biochemisch und funktionell charakterisiert. Als IFN-spezifische Kontrollelemente konnten in der proximalen Promotorregion drei Interferon-Stimulierte-Response-Elemente (ISRE) und mehrere GAS- (Gamma-Aktivierte-Sequenz) Motive identifiziert werden, deren Einfluss auf die Induzierbarkeit des IFRG28-Promotors mit Hilfe von Deletionskonstrukten in Reporergenassays untersucht wurde. Die Analyse ergab, dass die Aktivität der untersuchten Promotorregion in den ISRE begründet liegt. Um den individuellen Einfluss jedes der drei Motive auf die Transkription überprüfen zu können, wurden Punktmutationen in die einzelnen Elemente eingeführt. Die sequentielle Inaktivierung aller drei Motive zeigte, dass jedes ISRE allein funktionell ist, obwohl individuelle Unterschiede in ihrer Aktivität festgestellt wurden. Für die biochemische Charakterisierung wurde das Protein heterolog in Bakterien exprimiert und als aufgereinigtes GST-Fusionsprotein einer Sprague Dawley Ratte zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern injiziert. Nach Zellfusion und anschließendem Screening konnten 18 Hybridome identifiziert werden, von denen 17 ein spezifisches Signal im Western-Blot und in der Immunpräzipitation zeigten. Mit Hilfe der gewonnen Antikörper konnte nachgewiesen werden, dass IFRG28 sehr schnell durch IFN induziert wird, eine lange biologische Halbwertszeit von mehr als 8 h besitzt und sehr wahrscheinlich in vesikukären Strukturen lokalisiert ist. Zur Aufklärung einer möglichen Funktion wurden Zelllinien mit stabiler IFRG28-Expression hergestellt und auf eine veränderte Zellphysiologie nach Transgenexpression untersucht. Es stellte sich heraus, dass IFRG28 die zytopathischen Effekte einer Infektion mit Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) und Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) hinauszögert. Dieser Nachweis konnte an zwei verschiedenen Zelllinien erbracht werden, womit sichergestellt ist, dass die antivirale Aktivität kein Positionseffekt der integrierten DNA darstellt. Um den Zusammenhang einer antiviralen Wirkung mit der IFRG28-Expression näher zu prüfen, wurde die Replikation des EMCV in den konstitutiv exprimierenden Ba/F3 Zellen verfolgt. In diesen Versuchen konnte klar gezeigt werden, dass IFRG28 einen hemmenden Einfluss auf die virale Replikation ausübt.

Translation of abstract (English)

The present PhD work concerns the biochemical und functional characterization of the Interferon-regulated-Gene-28 (IFRG28) by the use of self established monoclonal antibodies and stably transfected cell lines. Analysis of the 5'-flanking sequence of the gene revealed the presence of three Interferon-Stimulated-Response-Elements (ISRE) as well as several GAS- (Gamma-Activated-Sequence) elements. Genomic fragments encompassing a portion of the IFRG28 5'-flanking region were inserted into reporter gene vectors and were analysed in reporter gene assays. The study of deletion constructs documented that the activity of the investigated promoter region is mediated by the ISRE. Point mutations in the ISRE sites were inserted in order to analyse their individual influence on the promoter strength. The sequential inactivation of all three ISRE motives revealed that each ISRE is functional although there are individual differences in activity following IFN treatment. For the generation of monoclonal antibodies the protein was expressed in bacteria and injected as purified GST-fusion protein into a Sprague Dawley rat. After cell fusion and subsequent screening 18 hybridomas were identified from which 17 secreted antibodies specific for IFRG28 in western-blot und immunopreciptitation. The analysis of its expression revealed that IFRG28 is rapidly induced after IFN treatment and has a long biological half life of more than 8 h. Immunofluorescence studies showed that IFRG28 is probably located within vesicular structures. For the functional characterization stably transfected cell lines were established and subsequently checked for a possible resistance to viral infections, since among the multitude of IFN-mediated effects viral resistance is the most sensitive. It turn out that IFRG28 is able to delay the cytopathic effects of cells infected with encephalo-myocarditis-virus (EMCV) and vesicular-stomatitis-virus (VSV). This finding was confirmed by two different cell lines, indicating that the antiviral activity was really due to IFRG28 expression and was not an unspecific property due to DNA integration. The IFRG28-mediated antiviral activity was checked on transcriptional level by infection of transfected Ba/F3 cells with EMCV. These experiments clearly demonstrated that IFRG28 inhibits viral replication of EMCV.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Zawatzky, Prof. Dr. Rainer
Date of thesis defense: 31 May 2005
Date Deposited: 10 Jun 2005 09:15
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Interferon, Cardiovirus, Vesicular-stomatitis-Virus
Uncontrolled Keywords: IFRG28IFRG28
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