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Characterization of antigen processing and presentation by peptide-linked MHC class I molecules

Tiwari, Neeraj

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Abstract

MHC-Klasse-I-Moleküle präsentieren gewöhnlich Peptide, die aus zytosolischen Antigenproteinen durch proteasomalen Verdau generiert und anschließend vom TAP-Peptidtransporter ins endoplasmatische Retikulum transportiert werden. Es können jedoch auch endozytierte Antigene für die MHC-Klasse-I-vermittelten Antigenpräsentation prozessiert werden, wobei dieser alternative Weg entweder in einer Proteasom/TAP-abhängigen oder unabhängigen Weise abläuft. Während diese so genannte „Kreuzpräsentation“ für einige exogene lösliche bzw. partikuläre Antigen beschrieben war, war zu Beginn dieser Arbeit die endolysosomale Prozessierung von MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden aus zelleigenen, membranständigen Proteinen noch weitgehend unverstanden. In meiner Dissertation habe ich die H-2Kb-vermittelte Antigenpräsentation von Klasse-I-Peptid-Fusionsproteinen als Modellantigensystem verwendet. Ich untersuchte den alternativen, TAP-unabhängigen Prozessierungsweg in immortalisierten Fibroblasten aus TAP-defizienten bzw. Tapasin-defizienten Mäusen sowie mit Hilfe von TAP-defizienten Maus-T-Lymphomzellen. Ich verwendete das aus dem Ovalbumin stammende Kb-bindende Peptid SIINFEKL in kovalenter Verknüpfung mit dem Aminoterminus von Kb- und Kd-Klasse-I-Molekülen, wobei die SIINFEKL-Sequenz am N-terminalen Ende durch verschiedene natürlich vorkommende und artifizielle Sequenzen verlängert wurde. Ich konnte zeigen, dass das SIINFEKL-Epitop aus zahlreichen Sequenzkontexten herausprozessiert und effizient gegenüber SIINFEKL/Kb-spezifischen B3Z T-Hybridomzellen präsentiert wurde. Die Präsentation dieser Peptid-Klasse-I-Konjugate war inhibierbar durch azidophile Amine und Inhibitoren der vakuolären Protonenpumpe, welche den pH von endosomalen Vesikeln anheben. Diese Inhibition weist auf eine Antigenprozessierung im endolysosomalen Weg hin, da sowohl die Funktion von endosomalen Hydrolasen als auch der vesikuläre Transport im endozytischen Weg pH-abhängig sind. Pepstatin A als Inhibitor der endolysosomalen Endoproteasen Cathepsin E und D war ebenfalls in der Lage, die Prozessierung von SIINFEKL-Peptiden aus SIINFEKL-Kd-Konjugaten zu blockieren. Ich konnte jedoch keine Hinweise auf eine Beteiligung der ER-Aminopeptidase ERAP1 bzw. der im trans-Golgi-Netzwerk exprimierten Endoprotease Furin bei der Prozessierung unserer membranassoziierten Modellproteine finden. N-terminale Verlängerungen des SIINFEKL-Epitops und verschiedene C-terminal flankierende Aminosäuren wurden in der Regel effizient entfernt, wobei Prolin als flankierende Aminosäure einschränkend auf die Prozessierung wirkte. Bemerkenswerterweise verwenden nicht nur TAP-defiziente, sondern auch Zellen mit voll funktionsfähigem TAP-abhängigen Peptidbeladungskomplex den alternativen endosomalen Weg der Antigenprozessierung. Dieser neuartige Befund ergab sich durch die gleichfalls in Wildtypzellen vorhandene Blockade der Präsention unserer Fusionsproteine durch Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung. Darüberhinaus untersuchte ich den Mechanismus der Internalisierung der Peptid-Klasse-I-Konjugate von der Zelloberfläche. Inhibitorstudien zeigten, dass sowohl die Clathrin-abhängige wie die Clathrin-unabhängige Endozytose bei der Internalisierung der Konjugate beteiligt war. Interessanterweise spielten Sortierungssignale in der zytoplasmatischen Domäne von Klasse-I-Molekülen keine Rolle für das Erreichen von prozessierungsaktiven Kompartimenten, da diese Domäne ohne Verlust der Antigenpräsentation deletiert werden konnten. Die Rezyklierung von peptidbeladenen Kb-Molekülen aus Endosomen zur Zelloberfläche zeigte sich ebenfalls unbeeinflusst durch Signale in der zytoplasmatischen Domäne. SIINFEKL-beladene Kb-Moleküle konnten durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie in frühen und späten Endosomen nachgewiesen werden. Diese Arbeit belegt die funktionelle Relevanz eines bislang noch wenig untersuchten, alternativen Antigenpräsentationswegs, der nach Internalisierung und endosomaler Prozessierung von internalisierten, endogen synthetisierten Transmembranproteinen zur Präsentation von Antigenpeptiden auf rezyklierenden MHC-Klasse-I-Molekülen führt.

Translation of abstract (English)

MHC class I molecules usually present peptides derived from antigens digested in the cytosol by proteasomes and transported into the ER by TAP. However, also antigens that are internalized into the endocytic tract can be processed for class I-mediated presentation in either a proteasome/TAP-dependent or a TAP-independent fashion. While this cross-presentation pathway is established for exogenous soluble and particulate antigens in professional antigen presenting cells (pAPC), little is known about the endolysosomal processing of endogenous transmembrane antigens into class I-binding peptides by non-pAPCs. In my thesis I investigated the Kb-restricted presentation of class I-peptide fusion proteins as a model antigen system. I studied the alternative, TAP-independent MHC class I antigen processing pathway in TAP1-/- and tapasin-/- immortalized fibroblasts as well as TAP-deficient RMA-S T lymphoma cells. I showed that the ovalbumin (OVA)-derived epitope SIINFEKL (S8L) is cleaved out of various sequence contexts when tethered to the N terminus of Kd and Kb and presented to SIINFEKL/Kb specific B3Z T hybridoma cells. Antigen presentation was inhibited by acidophilic amines and inhibitors of the vacuolar proton pump indicating processing in endosomes. Inhibitors of endolysosomal cysteine and aspartic proteases also interfered with presentation, whereas the ER aminopeptidase ERAP1 and the trans-Golgi endoprotease furin did not detectably contribute to processing. Fusion proteins containing short N-terminal extensions of S8L and different C-terminal flanking residues were efficiently presented while longer N-terminal extensions showed reduced presentation. Also, proline introduced as N- or C-terminal flanking residue of the S8L epitope resulted in reduced presentation. Not only TAP-deficient cells but also TAP-competent P815 and Ltk- cells utilized the vacuolar pathway for processing of peptide-tagged class I molecules. I have characterized the mode of fusion protein internalization from the cell surface and the intracellular location of SIINFEKL-loaded Kb molecules. Both filipin and chlorpromazine partially blocked antigen presentation in reappearance assays after acid stripping of the cell surface, suggesting both clathrin-independent and -dependent pathways of internalization. Unexpectedly, the cytoplasmic tail of class I harboring several putative sorting signals could be truncated without any loss of the capacity of class I-peptide conjugates to be targeted to vacuolar processing compartments and of peptide-loaded class I molecules to recycle to the surface. SIINFEKL-loaded Kb molecules recognized by the antibody 25.D1-16 were found in small peripheral vesicles that showed a substantial colocalization with the early endosomal marker EEA1. A subset of 25.D1-16-positive vesicles were also labeled for the late endosomal marker mannose-6-phosphate receptor. I thus present evidence in this thesis for a TAP-independent, class I-restricted pathway operative in non-professional antigen presenting cells that result in the efficient presentation of endogenous, membrane-associated antigens after processing in endosomes.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. G.J. Haemmerling, Prof.
Date of thesis defense: 4. July 2005
Date Deposited: 29. Jul 2005 14:53
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 530 Physics
Controlled Keywords: MHC class I, Antigen processing, Antigen presentation
Uncontrolled Keywords: MHC Klasse I, Antigenprozessierung, AntigenpraesentationMHC class I, Antigen processing, Antigen presentation
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