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Der Transkriptionsfaktor JunB in der zellulären Hypoxie-Antwort und in der Angiogenese : Entschlüsselung der übergeordneten Signalwege und Identifizierung und funktionelle Analyse des JunB-Zielgens CBFbeta

Pein, Oliver Tobias

English Title: The transcription factor JunB in the cellular hypoxia response and in angiogenesis : deciphering of upstream signaling pathways and identification and functional analysis of the JunB target gene CBFbeta

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PDF, German
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Abstract

Die Induktion von Angiogenese und fehlregulierte Signaltransduktionswege, die Proliferation und Überleben von Zellen beeinflussen, sind Kennzeichen von Krebs. Angiogenese wird hauptsächlich durch VEGF aktiviert, dessen Expression unter hypoxischen Bedingungen über den Transkriptionsfaktor HIF induziert wird. JunB-defiziente Mäuse zeigen eine vaskulären Phänotyp und sterben zwischen Tag 8,5 und 10,5 der Embryonalentwicklung. Die auffallenden phänotypischen Übereinstimmungen zwischen JunB-defizienten Embryonen und Mäusen ohne funktionellem VEGF, VEGFR-1, HIF-1a, HIF-2a und ARNT haben uns veranlasst, die molekularen Mechanismen der JunB-Regulation unter hypoxischen Bedingungen zu untersuchen. Expressionsanalysen zeigen, dass unter hypoxischen Bedingungen das junB-Gen selbst induziert wird. Diese Induktion verläuft über NFkB und ist unabhängig von den MAP-Kinasen JNK, ERK und p38 sowie von HIF-1a. Das Fehlen von JunB führt zu einer verminderten basalen Transkription von VEGF und verhindert die Hypoxie-vermittelte VEGF-Induktion fast vollständig, woraus wir schließen, dass JunB ein wichtiger Aktivator der VEGF-Transkription ist. Andererseits wird JunB nicht für die Transkription seines eigenen Gens benötigt, sondern scheint eher seine Transkription unter hypoxischen Bedingungen zu modulieren. Zur Identifizierung neuer JunB-Zielgene, die an der zellulären Hypoxie-Antwort beteiligt sind, wurde eine DNA-Microarray Expressionsanalyse mit heterozygoten und JunB-defizienten Endothelioma-Zellen durchgeführt, die entweder unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden. In einem in vitro Angiogenese-Modell zeigen diese JunB-defizienten Endothelioma-Zellen Defekte in der Röhrenbildung und imitieren den Phänotyp JunB-defizienter Embryonen. Durch die Analyse des DNA-Microarray Experiments konnten 46 Gene identifiziert werden, die unter hypoxischen Bedingungen eine JunB-abhängige Expression aufweisen. Der Transkriptionsfaktor CBFb, der im Verlauf der Arbeit genauer untersucht wurde, wird durch JunB und c-Fos induziert, wie Kotransfektionsanalysen mit einem Reporterkonstrukt zeigen, welches unter der Kontrolle des 1600 bp langen stromaufwärts von CBFb gelegenen Sequenzbereichs steht. RT-PCR- und IHC-Analysen in der Milz und dem Knochenmark von Mäusen mit defizienter oder stark verminderter JunB-Expression belegen, dass die Transkription von CBFb auch in vivo durch JunB reguliert wird. Die transgene Expression von JunB heben den Angiogenesedefekt in junB-/-- Endothelioma-Zellen, der im in vitro Angiogenese-Modell beobachtet wurde, fast vollständig auf. Die JunB-abhängige Transkription von CBFbist demnach ein wichtiger Bestandteil der Gefäßbildung und resultiert, wenn fehlreguliert, zu einer gestörten Angiogenese, wie sie in JunB-defizienten Embryonen beobachtet werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zum ersten Mal die molekularen Mechanismen, die zur Hypoxie-vermittelten Induktion von junB führen. Die Identifikation von CBFbals JunB-Zielgen eröffnen die Möglichkeit, dass die JunB-abhängige CBFbExpression nicht nur in der Angiogenese eine wichtige Rolle spielt, sondern auch bei Knochenerkrankungen und myeloiden Leukämien von entscheidender Bedeutung ist.

Translation of abstract (English)

Induction of angiogenesis and dysregulation of signal transduction pathways regulating cell proliferation and viability are hallmarks of cancer. Angiogenesis is primarily activated by VEGF, whose expression is induced by hypoxia via the transcription factor HIF. Several vascular and angiogenic defects account for an early embryonic lethality of JunB-deficient mice between E 8.5 and E 10.5. The striking phenotypic similarities between JunB-knock out embryos and embryos lacking VEGF, VEGFR-1, HIF-1a, HIF-2a and ARNT promted us to investigate the underlying molecular mechanisms of JunB regulation under hypoxic conditions. Therefore, a comparative analysis of murine wildtype, junB-/-- and HIF-1a-/--fibroblasts as well as fibroblasts with repressed NFB activity was performed. Expression analysis revealed that the junB gene itself is rapidly induced under hypoxic conditions. This observed induction requires NFkB and does not depend on the activity of the MAP kinases JNK, ERK or p38 nor on the Hypoxia inducible factor HIF-1a. Loss of JunB strongly decreases basal transcription of VEFG and abolishes VEGF induction in hypoxia almost completely, suggesting that JunB is an important activator of VEGF transcription. On the other hand, JunB is not required for the induction of its own gene, but rather modulates its transcription under hypoxic conditions since induction of the junB-neo fusion transcript in JunB-deficient takes place and is induced even to a higher level compared to the induction of endogenous junB in wildtype cells. In order to identify novel JunB target genes that are involved in the cellular hypoxia response and in angiogenesis, we performed an DNA-chip based large scale comparative gene profiling analysis using heterozygous and JunB knock out endothelioma cells that were incubated either under normoxic or hypoxic conditons. JunB-deficient endothelioma cells mimick in an in vitro angiogenesis model the vascular phenotype of junB-/- embryos in vivo. The comparative gene profiling analysis revealed 46 genes to be differentially expressed in a JunB dependent manner under hypoxic conditions. The  subunit of the Core binding factor, CBFbwas investigated in more detail. Reportergene analysis with a newly cloned reporter containing 1600 bp upstream of the CBF gene demonstrated that CBFb is strongly induced by coexpression of JunB and c-Fos. RT-PCR and IHC analyses in mice with either deficient or compromised expression of JunB in the hematopoetic compartments of the spleen and the bone marrow showed that CBFbwas also regulated by JunB in vivo. The transgenic expression of CBFb in junB-/- endothelioma cells rescued the angiogenic defect observed in the in vitro matrigel angiogenesis model almost completely, suggesting that the JunB- dependent expression of CBFbis a major event in angiogenesis and leads, when dysregulated, to a disturbed angiogenesis as observed in JunB-deficient mice.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Angel, Prof. Dr. Peter
Date of thesis defense: 29. July 2005
Date Deposited: 04. Aug 2005 11:20
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hypoxie, Angiogenese
Uncontrolled Keywords: AP-1 , JunB , CBFbetaHypoxia , Angiogenesis , AP-1 , JunB , CBFbeta
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