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Mutational Analysis of the Export Targeting Motif of Fibroblast Growth Factor 2, a Mediator of Tumor-Induced Angiogenesis

Engling, Andre

German Title: Mutationsanalyse des Exportmotifs des Fibroblasten Wachstumsfaktors 2, einem Mediator der tumorinduzierten Angiogenese

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Abstract

The majority of secretory proteins is exported from mammalian cells by the classical secretory pathway involving subcellular compartments such as the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi apparatus. However, basic fibroblast growth factor (FGF2), a potent mediator of tumor-induced angiogenesis, has been shown to be secreted by a non-classical pathway that does not depend on the functions of the ER and the Golgi apparatus. The molecular characterization of the FGF2 export mechanism is not only a fundamental problem in cell biology but also of great interest for biomedical research since it may pave the way for the development of a novel class of anti-angiogenic drugs. In this thesis, a robust model system designed to quantitatively assess FGF2 secretion under various experimental conditions was developed. A retroviral expression system was established in CHO cells that allows for a stable integration of reporter constructs whose expression can be induced by doxicycline. In order to monitor expression of FGF2 reporter molecules they were constructed as GFP fusion proteins. Based on this experimental system, secretion of FGF2-GFP can be quantified by flow cytometry, confocal microscopy and biochemical methods since exported FGF2-GFP binds to cell surface heparan sulfate proteoglycans and, therefore, is accessible by membrane-impermeable tools such as antibodies and biotinylation reagents. In the second part of this thesis, a systematic mutational analysis of the FGF2 open reading frame was conducted in order to identify cis elements that direct FGF2 to its export machinery. Initial experiments revealed the identification of FGF2 mutants that are defective in binding to heparan sulfate proteoglycans. Such mutants were neither detectable on the cell surface nor in the medium of cells suggesting that the interaction of FGF2 with heparan sulfate proteoglycans does not only play a role in FGF2 signaling but also in the overall process of FGF2 externalization from mammalian cells. A collection of more than a hundred FGF2 mutants and corresponding stable cell lines described in this thesis now provide a basis for future studies in order to conduct a detailed analysis of determinants required for FGF2 secretion.

Translation of abstract (German)

Proteine mit extrazellulären Funktionen werden typischerweise über den klassischen sekretorischen Transportweg exportiert, in den subzelluläre Kompartimente wie das endoplasmatische Retikulum (ER) und der Golgi-Apparat involviert sind. Der Wachstumsfaktor Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) wird hingegen über einen nicht-klassischen Weg sezerniert, der nicht von der Funktion des ER und dem Golgi-Apparat abhängig ist und dessen molekulare Komponenten bisher noch völlig unbekannt sind. Die Aufklärung dieses Prozesses ist einerseits eine interessante Fragestellung in der Grundlagenforschung und andererseits von grösstem biomedizinischen Interesse, da FGF2 eine unmittelbare Rolle bei der Tumor-induzierten Angiogenese zukommt. In dieser Arbeit wurde ein robustes Modellsystem entwickelt, mit dessen Hilfe die Freisetzung von FGF2 durch Säugetierzellen exakt quantifiziert werden kann. Unter Verwendung eines retroviralen Expressionssystems wurden CHO Zellen generiert, die ein aus FGF2 und GFP bestehendes Reportermolekül in Doxicyclin-abhängiger Weise exprimieren. So konnte die Sekretion des FGF2-GFP Fusionsproteins durch Flusszytometrie, konfokale Laserscanmikroskopie und biochemische Analysen mittels Zelloberflächenbiotinylierung exakt bestimmt werden, da extrazelluläres FGF2 an Heparansulfat-Proteoglykane der Zelloberflächen bindet. Die GFP-abgeleitete Fluoreszenz des Reportermoleküls wurde zur Normalisierung der Sekretionseffizienz auf der Basis der Expressionsrate genutzt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine systematische Analyse des offenen Leserasters von FGF2 bezüglich möglicher Exportmotive durchgeführt. Durch eine Zufallsmutagenese, den gezielten Austausch von Oberflächenresten sowie die systematische Verkürzung von N- und C-Terminus wurden mehr als 100 FGF2 Mutanten generiert und zur Etablierung stabiler Zelllinien verwendet. Mit dem oben beschriebenen System erfolgte eine vollständige Charakterisierung bezüglich Expression, Bindung an Heparansulfate und Exporteffizienz. Unter anderem wurden FGF2 Mutanten identifiziert, die die Fähigkeit zur Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane vollständig verloren haben. Interessanterweise konnte diese FGF2 Mutanten weder an der Zelloberfläche noch im Medium detektiert werden. Hieraus wurde geschlossen, dass die funktionelle Interaktion von FGF2 mit Heparansulfat-Proteoglykanen nicht allein auf Signaltransduktionsprozesse beschränkt ist, sondern bereits eine Rolle bei der Sekretion von FGF2 spielt. Die in dieser Arbeit generierte Kollektion von FGF2 Mutanten und der zugehörigen Zelllinien bildet nun die Basis für eine detaillierte Analyse der Determinanten in FGF2, die für den Exportprozess von Bedeutung sind.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Walter Nickel, Prof.
Date of thesis defense: 21 November 2005
Date Deposited: 01 Dec 2005 12:57
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Fibroblastenwachstumsfaktor
Uncontrolled Keywords: FGF2 , Mutationsanalyse , unkonventionelle Sekretion , MembrantranslokationFGF2 , fibroblast growth factor , mutational analysis , unconventional secretion , membrane translocation
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