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Bioinspired Catalysts for Phosphoryl Transfer Reactions

Jagoda, Malgorzata

German Title: Bioinspirierte Phosphorylierungskatalysatoren

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Abstract

Phosphoryl transfer reactions are ubiquitous in biology and are usually catalyzed by metalloenzymes. For a number of phosphoryltransfer enzymes, including the exonuclease subunit of DNA polymerase I, a mechanism involving two metal ions and double Lewis-acid activation of the substrate, combined with leaving group stabilisation, has been proposed. Aim of this thesis was the study of low-molecular-weight models of phosphoryl transfer metalloenzymes. The focus was in particular on the macrocyclic dicopper(II) complex LCu2, which is the first transesterification catalyst for highly inert dialkyl phosphates and a mimic of the exonuclease subunit of DNA polymerase I. For the first time, a crystal structure of LCu2 with a coordinated phosphodiester was obtained. [LCu2(1,3-µ-DMP)(NO3)](NO3)2 (2) contains a 1,3- bridging phosphodiester. By extensive UV-Vis and pH metric titrations, the metal complex species present in methanolic LCu2/DMP solution have been identified. In particular it has been shown, that [LCu2(DMP)(OCH3)]2+ is the active species and that coordinated methanolate (and not free methanol or methanolate) is the nucleophile which attacks the P-atom of the substrate. DFT calculations (in cooperation with the group of Prof. Smith, IWR Heidelberg) confirm that the 1,3-DMP bridged complex is the dominant species in solution. By extensive kinetic studies including rate dependence on catalyst concentration, saturation kinetics, pH dependence on rate and dependence on rate on substrate structure, solid experimental data have been obtained which support the proposal of a reaction mechanism related to exonuclease subunit of DNA polymerase I. The applicability of LCu2 as a catalyst for the phosphorylation of various alcohols by dimethyl phosphate has been evaluated. A unique functional group tolerance of the catalyst and selectivity for dialkyl phosphates over alkyl carboxylates is observed. Screening of ATP hydrolysis by Zr(IV) and Eu(III) complexes was examined using a robotic liquid-handling workstation. It was found that a phosphate detection assay using molybdate is compatible with the presence of these high-valent metal ions. ATPase activity of the metal is modulated by the ligands, and the most efficient catalyst is the Zr complex of the tetracarboxylate ligand L6 at both pH 4 and pH 7. This is in contrast to Zr promoted DNA hydrolysis where polycarboxylate ligands have been shown to quench strongly the phosphoesterase activity of the metal ion.

Translation of abstract (English)

Phosphoryl-Transferreaktionen sind in der Biologie allgegenwärtig und werden üblicherweise von Metalloenzymen katalysiert. Für eine Vielzahl von Phosphoryltransfer Enzymen, die Exonuclease Untereinheit der DNA-Polymerase I eingeschlossen, wurde ein Mechanismus vorgeschlagen, der durch zwei Metallionen eine doppelt lewissaure Aktivierung des Substrats mit einer Stabilisierung der Abgangsgruppe kombieniert. Das Ziel dieser Arbeit war, niedermolekulare Modelle von Phosphoryltransfer-Metalloenzymen zu untersuchen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf dem makrocyclischen Dikupfer(II)-Komplex LCu2, dem ersten Komplex, der als Modellkomplex der Exonuclease Untereinheit der DNA Polymerase I die Umesterung inerter Dialkylphosphate katalysiert. Es konnte zum ersten Mal eine Kristallstruktur von LCu2 mit koordinierten Phosphodiestern erhalten werden. [LCu2(1,3-µ-DMP)(NO3)](NO3)2 (2) enthält einen 1,3-verbrückenden Phosphodiester. Über umfangreiche UV-Vis und pH-Titrationen wurden die in methanolischer Lösung von LCu2 und DMP vorliegenden Metallkomplex Spezies identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass [LCu2(DMP)(OCH3)]2+ die aktive Spezies ist, und dass koordiniertes Methanol (und nicht freies Methanol oder Methanolat) das Nucleophil ist, das das Phosphoratom des Substrates angreift. DFT-Rechnungen (in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Smith, IWR Heidelberg) bestätigen den 1,3-DMP verbrückten Komplex als die dominierende Spezies in Lösung. Eingehende kinetische Untersuchungen, u.a. zur Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration des Katalysators, zur Sättigungs-Kinetik, zur Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom pH-Wert sowie der Substratstruktur, lieferten experimentelle Daten, die einen vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus mit Bezug zur Exonuclease-Untereinheit der DNA-Polymerase I untermauern. Außerdem wurde die Anwendbarkeit von LCu2 als Katalysator für die Phosphorylierung verschiedener Alkohole mit Dimethylphosphat untersucht. Es konnte eine einzigartige Toleranz des Katalysators gegenüber funktionellen Gruppen sowie eine einzigartige Selektivität für Dialkylphosphate gegenüber Alkylcarboxylaten beobachtet werden. In einem zweiten Projekt wurde an einem Pipettierroboter ein Screening-Verfahren für die ATPase Aktivität von Zirconium(IV)- und Europium(III)-Komplexen entwickelt. Es wurde gezeigt, dass Molybdat als Reagenz für den Phosphat-Nachweis mit diesen hochvalenten Metallionen kompatibel ist. Die ATPase Aktivität der Metallionen wird stark durch den Liganden beeinflusst. Zirconium-Komplexe eines Tetracarboxylat-Liganden L6 wurden sowohl bei pH 4 als auch pH 7 als aktivste Spezies identifiziert. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Beobachtungen für die Zirconium vermittelte DNA-Hydrolyse, bei der Polycarboxylatliganden die Phosphoresterase-Aktivität des Metalllions unterdrücken.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krämer, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 21 October 2005
Date Deposited: 30 Nov 2005 10:38
Date: 2005
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: DNS-Polymerase <alpha->
Uncontrolled Keywords: Phosphorylierungskatalysatoren , DNA-Polymerase , Phosphoryltransfer , Makrocyklen , Dikupfer(II)-Komplexphosphoryltransfer , low-molecular-weight , DNA polymerase , dicopper(II) complex
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