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Computational imaging of dynamic nuclear processes in living somatic and germ line cells

Bacher, Christian Peter

German Title: Computer-basierte Bildanalyse dynamischer Prozesse im Zellkern somatischer Zellen und Stammzellen

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Abstract

Lichtmikroskopische Techniken können benutzt werden, um den Einfluss der räumlichen und zeitlichen Organisation von Chromatin und assoziierten nukleären Faktoren zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit möchte ich mit zwei biologischen Ansätzen die Bedeutung der quantitativen Extraktion von raum- und zeitabhängigen Parametern aus mikroskopischen Bildern untersuchen und deren Auswirkung auf den heutigen Wissensstand über die nukleäre Topologie zeigen. Zusätzlich soll die Software-Plattform Tikal, die ich zur Vereinfachung der quantitativen Analyse multidimensionaler mikroskopischer Bilder entwickelt habe, vorgestellt werden. Im ersten Projekt habe ich die räumliche Position und Verteilung des X-chromosomalen Inaktivierungszentrums (Xic) während der X-chromosomalen Inaktivierung in Zellkernen weiblicher und männlicher embryonaler Mausstammzellen (ES-Zellen) mittels dreidimensionaler (3D) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), sowie anhand von Lebendzellaufnahmen mittels Lac-Operator markierter Xic-Transgene untersucht. Tikal wurde zur Bildverarbeitung und zur quantitativen Bestimmung der Distanzen zwischen den Xic-Loci in weiblichen ES-Zellen, sowie zur Messung der Abstände der Xic-Signale zur nukleären Peripherie in weiblichen und männlichen ES-Zellen verwendet. In weiblichen ES- Zellen wies eine kleine Population von Zellen eine Kolokalisation der beiden Xic-Loci während der frühen Differenzierungsphase auf. Die funktionelle Bedeutung dieser Annäherung der Xic-Loci während der X-Inaktivierungsphase wird bestärkt durch ihr Fehlen in zwei ES-Zellmutanten, die Defizite in den X-chromosomalen Zähl- und Selektionsmechanismen aufweisen. Ausserdem konnte ich zeigen, dass der Xic-Lokus nahe der nukleären Membran lokalisiert ist. Diese periphere Lage ist am stärksten bei männlichen ES-Zellen während der frühen Differenzierung ausgeprägt. Eine solche räumliche Absonderung des Lokus könnte notwenig sein, um den aktiven Zustand des einzigen X-Chromosoms beizubehalten. Im zweiten Projekt habe ich die Dynamik der nukleären Organisation mit Hilfe von zwei inerten nukleären Körpern, GFP-NLS-vimentin-Partikeln und mikroinjizierten Polystyren-Kügelchen, untersucht. Um die Mobilität der Partikel in sich bewegenden Zellen und in Zellkernen, die ihre Form verändern, quantitativ verfolgen zu können, verwendete ich Tikal. So konnte ich aus Serien mikroskopischer Bilder lebender Zellen die relevanten Parameter mit Hilfe von Tracking Methoden (Verfolgung von einzelnen Objekten in Raum und Zeit) und Bewegungsanalysen extrahieren. Kinetische Analysen zeigten ein Überwiegen nukleärer Partikel mit eingeschränkten Diffusionseigenschaften. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich schliessen, dass Chromatindichte und Chromatinumbau auf molekularer Ebene die Beweglichkeit von Proteinbestandteilen innerhalb des Zellkernes direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit möchte ich zunächst die beiden biologischen Fragestellungen erklären und den aktuellen Wissensstand auf dem Gebiet der nukleären Architektur, X-chromosomalen Inaktivierung und Bildverarbeitung kurz darstellen. Anschliessend möchte ich die spezifischen Techniken der Bildverarbeitung, die ich zur Bearbeitung der mikroskopischen Aufnahmen verwendet habe, vorstellen. Zusätzlich sollen das Konzept und die Funktionen meiner Bildverarbeitungs-Software Tikal erläutert werden. Die dann folgenden Kapitel werden sich mit den beiden Projekten über die Analyse der Xic-Lokalisation in ES-Zellen und über die räumliche und zeitliche Verfolgung nukleärer Partikel beschäftigen.

Translation of abstract (English)

Light microscopy techniques have been used to investigate the influence of the spatio-temporal organization of chromatin and associated nuclear factors. In this thesis I will present with two biological examples the importance of quantitative extraction of spatial and temporally dependent parameters from microscopic images and their impact on the knowledge of topological constraints in the nucleus. Additionally, I introduce a software platform, called Tikal, which I developed to facilitate the quantitative image analysis of multidimensional microscopic images. In the first project I investigated the spatial localization and distribution of the X-chromosomal inactivation center (Xic) locus during the X-chromosomal inactivation process in female and male mouse embryonic stem (ES) cell nuclei using 3 dimensional (3D) fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis, as well as live cell imaging with Lac operator-tagged Xic transgenes. I used Tikal for the image processing and the quantitative analysis of the inter Xic locus distances in female cells and the Xic signal distances to the nuclear periphery of female and male cells. In female ES cells, a small population in which the two Xics are co-localized can be detected in early differentiation. The functional importance of this apparent cross-talk between Xics during the initiation time window when X-inactivation begins is underscored by the fact that it cannot be detected in two mutant ES cell lines that are incapable of counting and choice. Further I found that the Xic locus lies very close to the nuclear envelope. This peripheral location is most pronounced in male ES cells during early differentiation. Such a sequestration of the Xic may be indicative in order to maintain the active state of the single X-chromosome. In the second project I investigated nuclear body dynamics of two different types of inert nuclear particles, namely particles produced of GFP-NLS-vimentin and microinjected polystyrene beads in order to study the dynamics of nuclear organization. To quantitatively follow particle movement on the background of moving cells and shape changing nuclei, I used Tikal to work on images derived from live cell time-lapse microscopy and extracted relevant parameters with single particle tracking and mobility analysis. Kinetic analysis revealed predominantly obstructed diffusion for nuclear particles and I could conclude that chromatin density and thereby chromatin remodeling on the molecular level directly influences the mobility of protein components within the nucleus. In this thesis I will first introduce the two biological questions by reviewing our knowledge about nuclear architecture, X-chromosomal inactivation and image processing. I will then introduce specific image processing techniques I used for the processing of biological microscopy images. Additionally, I present the concept and features of the software platform Tikal. The following chapters will describe the two projects on Xic localization analysis in mouse ES cells nuclei and on nuclear particle tracking, respectively.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Roland
Date of thesis defense: 23. November 2005
Date Deposited: 02. Dec 2005 07:36
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Stammzelle, X-Chromosom, Dreidimensionale Bildverarbeitung, Chromatin, Vimentin, Tikal, Segmentierung, Bildverarbeitung, Zellkern
Uncontrolled Keywords: Xist , X-Inaktivierung , Partikelverfolgung , konfokale Mikroskopie , somatische ZellenX-inactivation , particle tracking , registration , segmentation , X inactivation center (XIC)
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