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Entwicklung und Anwendung neuartiger Trägeroberflächen zur kombinatorischen Peptidsynthese mit Aminosäure-Tonerpartikeln

Beyer, Mario

English Title: Design and application of novel solid support surfaces for the combinatorial peptide synthesis with amino acid toner particles

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PDF, German
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Abstract

Die Steigerung der Komplexität von Peptidbibliotheken bzw. Peptidarrays ist ein wichtiger Schritt bei der Identifizierung von bislang unbekannten Ursachen und Verläufen häufiger Krankheiten. Die bereits erfolgreich vollzogene Weiterentwicklung der etablierten Tintenstrahl-Drucktechnik zu laser- und tonerbasierten Systemen hinsichtlich Druckauflösung und Druckgeschwindigkeit könnte ein möglicher Ansatzpunkt für zukünftige Peptidarrayproduktionen dazu sein. Zu diesem Zweck wurden Aminosäuretoner entwickelt und charakterisiert, die mit einem technisch modifizierten Laserdrucker auf Trägeroberflächen gedruckt und mit ihnen zur Reaktion gebracht werden können. Die Entwicklung geeigneter Trägeroberflächen stand dabei im Mittelpunkt dieser Arbeit. (1.) Oberflächenmodifikationen: Es konnten proteinresistente Glasoberflächen als Trägermaterialien für die kombinatorische Peptidsynthese im Arrayformat mit Hilfe einer UV-induzierten Graftpolymerisation von Poly(ethylenglykol)methacrylat (PEGMA) erzeugt werden. Zuvor werden dazu auf Glasträgern Monoschichten aus 7-Octenyltrichlorosilan hergestellt, auf denen anschließend durch Ozon photosensitive, oberflächengebundene Radikalstarter generiert wurden. Die Ozonisierung der Silanfilme wurde mittels XP- und IR-Spektroskopie sowie Messungen des Kontaktwinkels zeitlich verfolgt. Die Optimierung der Graftfilmdicke geschah durch Variation von Bestrahlungsdauer und Monomerkonzentration und erfolgte durch ellipsometrische Schichtdickenmessungen an Siliziumoberflächen. Die Einführung von Aminogruppen mit einer variablen Funktionalitätsdichte erfolgte über die Veresterung von Carbodiimid-aktiviertem Fmoc-ß-Alanin. Die erzeugten Filme sind gegenüber 91 %iger Trifluoressigsäure (TFA) stabil und darüber hinaus resistent gegenüber unspezifischer Proteinadsorption. Die Verifizierung der Proteinresistenz erfolgte durch Inkubation mit vier verschiedenen Proteinlösungen (Fibrinogen, Lysozym, BSA und g-Globulin) in PBS-Puffer und anschließender Auswertung von N1s-XP-Detailspektren. (2.) Aminosäure-Tonerpartikel: Es konnten mit allen zwanzig voraktivierten, proteinogenen Aminosäuren (Fmoc-L-Aminosäure-Pentafluorphenylester) Tonerpartikel auf der Basis von OKI-Farbtonern synthetisiert und charakterisiert werden, die vergleichbare Größenverteilungen im Bereich von 9 µm und Ladungseigenschaften wie ihre Vorbilder aufweisen. Ihre Fähigkeit zur qualitativen Kopplung an aminoterminierte Glasoberflächen konnte über ein Anfärben der entschützten Aminogruppen nach der Reaktion mit der Oberfläche gezeigt werden. (3.) Peptidsynthesen mit Aminosäuretonern: Drei verschiedene Peptidepitope (DTYRYIDYA, YPYDVPDYA und DYKDDDDK) wurden mit Aminosäuretoner (und zum Vergleich aus einer Lösung in DMF) auf mit Rink-Linker modifizierten, PEG-gegrafteten Glasobjektträgern großflächig synthetisiert. Die Kopplungsausbeuten der einzelnen Syntheseschritte wurden UV-spektroskopisch verfolgt. Nach Abspalten der Peptide vom Träger mit TFA konnten alle drei Sequenzen durch MALDI-TOF-Messungen als Amide identifiziert werden. (4.) Peptidlaserdrucker und Peptidarray: Der entwickelte Peptidlaserdrucker ist in der Lage, innerhalb von ca. 70 Sekunden einen derivatisierten Glasträger (21 cm x 20 cm) mit ca. 155.000 Spots (Ø ca. 250 µm) zu bedrucken. Er basiert auf der Technik der Farblaserdruckerserie C7200 von OKI und besteht aus zwanzig hintereinander angeordneten Tonerkartuschen in einer Rahmenkonstruktion. Der zu bedruckende Träger wird auf einem Schlitten mit präzisem Linearantrieb bewegt. Ein erster Test-Array vor Inbetriebnahme des Druckers, bestehend aus den schachbrettartig angeordneten Epitopen YPYDVPDYA und DYKDDDDK, wurde durch Ausdruck der Aminosäuretoner auf Laserdruckerfolien und anschließenden Transfer auf den Glasträger synthetisiert. Der Nachweis erfolgte durch eine Inkubation des Trägers mit Mischungen aus den spezifischen Erst- und den fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpern und Auswertung mit einem Fluoreszenzscanner.

Translation of abstract (English)

Complexity improvement of peptide libraries or peptide arrays respectively is an important step to identify unknown reasons and courses of common diseases. The already successfully implemented development of established ink-jet printing technology to laser and toner based systems with respect to speed and resolution could be a starting point for future peptide array productions. Therefore amino acid toners were developed and characterized which can be printed onto derivatized supporting materials by a technical modified laser printer. Centre of this work was the development of suitable supporting materials. (1.) Surface Modifications: Protein resistant glass surfaces were generated as supporting materials for the combinatorial peptide synthesis by means of UV induced graft polymerization of poly(ethylene glycol) methacrylate (PEGMA). Therefore glass slides were silanized with 7-octenyltrichlorosilane and ozonized to produce surface-bound photosensitive polymerization initiators. The ozonization of the silane films was monitored over the time by XP and IR spectroscopy as well as contact angle measurements. The optimization of grafted film thickness was made by verifying both time of irradiation and monomer concentration. Film thickness was measured ellipsometrically on likewise graftpolymerized silicon surfaces. Introducing of amino groups with a variable density was performed with carbodiimide mediated esterifications of fmoc-ß-alanine. Those films are stable to TFA (91 %) and are able to prevent unspecific protein absorption. Protein resistance was verified with four different proteins (fibrinogen, lysozyme, BSA, and g-globuline) in PBS buffered solutions by analyzing N1s detail XP spectra. (2.) Amino Acid Toner Particles: Toners of all twenty proteinogenic amino acids (fmoc-L-amino acid pentafluorphenylesters) based on OKI toners could be synthesized and characterized with comparable particle size distributions (9 µm) and charging properties. They were coupled to amino modified glass surfaces, and free amino groups were stained after deblocking with bromophenol blue. (3.) Peptide Syntheses with Amino Acid Toners: Three different peptide epitopes (DTYRYIDYA, YPYDVPDYA, and DYKDDDDK) were synthesized on modified, PEG grafted glass supports with an attached Rink linker. To compare these results syntheses in solution (DMF) were made. Coupling efficiencies were monitored with UV/Vis spectroscopy. After splitting off the peptides with TFA all three sequences could be identified as amides. (4.) Peptide Laser Printer and Peptide Array: The developed peptide laser printer is able to print ca. 155,000 spots onto a glass support (21 cm x 20 cm) within about 70 sec. The average spot diameter is about 250 microns. It is based on the four-color laser printer series C7200 of OKI and consists of twenty toner cartridges which are arranged one after another inside a framework construction. The slide for printing is fixed on a sledge with a precise linear drive below the cartridges. A simple test array was produced by printing amino acid toners first to transparencies and then transferred to modified glass slides. The array consisted of a chessboard-like pattern of epitope YPYDVPDYA and DYKDDDDK. The successful synthesis was proved by incubating the slide with a mixture of specific first and fluorophore-labeled secondary antibodies and analyzing by means of a fluorescence scanner.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dahint, Dr. rer. Reiner
Date of thesis defense: 2. December 2005
Date Deposited: 06. Dec 2005 14:42
Date: 2005
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Laserdrucker
Uncontrolled Keywords: Peptidarray , Graftpolymerisation , Proteinresistenz , Tonerpartikelpeptide array , graft polymerization , protein resistance , toner particles , laser printer
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