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In vitro Selektion von Ribozymen für eine 1,3-dipolare Cycloaddition

Zerreßen-Harte, Andreas

English Title: In vitro selection of ribozymes for an 1,3-dipolar cycloaddition

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PDF, German
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Abstract

Ribonukleinsäuren sind Moleküle, die ein derart breites Reaktionsspektrum besitzen, dass man die Existenz einer früheren „RNA Welt“ annehmen kann, in der alle biologischen Prozesse unter Beteiligung diesen Biomolekülen abgelaufen sind. Wichtige experimentell bewiesene Fähigkeiten von RNA beinhalten die Bindung einer Vielzahl von unterschiedlichen Substraten, ihren ribosomal katalytischen Beitrag zur Proteinsynthese in vivo und natürlich auch ihre Katalysefähigkeit bei chemischen Umsetzungen in vitro. Die Anwendung der letzten Eigenschaft resultiert in der Wirkstoffforschung und der Diagnostik in der Entwicklung von maßgeschneiderten RNA-basierten Enzymen (Ribozyme), die durch entsprechende Techniken erhalten werden können. Einen Beitrag zur Erweiterung dieser Techniken leistet diese Arbeit. Sie beschreibt den Aufbau, die Etablierung und die Analyse einer neuen Variante eines Selektionssystems zur Generierung von Ribozymen unter Verwendung von kurzlebigen, hoch reaktiven in situ generierten Substraten. Für die Etablierung der Methode wurde als Zielreaktion eine in der organischen Chemie zum Aufbau von Heterocyclen essentielle Reaktion gewählt - die 1,3-dipolare Cycloaddition. Kombinatorische RNA-Bibliotheken wurden nach aktiven Molekülen durchsucht, die eine Reaktion zwischen einem Acrylat- funktionalisierten RNA-Konjugat und einem biotinylierten Nitriloxid katalysierten. Dabei wurde die Methode der direkten Selektion mit spaltbaren linkergekoppelten Reaktanden verwendet. Der dipolare Acrylat-Reaktant wurde über einen flexiblen Dinukleotidlinker an die RNA durch enzymatische Ligation gekoppelt. Eine innerhalb diese Linkers positionierte photospaltbare o-Nitrophenylgruppe sollte zum einen die Regioselektivität der Selektionsreaktion gewährleisten, zum anderen sollte sie möglichen Nebenreaktionen verhindern. Nach der Reaktion konnten aktive RNA-Moleküle von nicht umgesetzten Sequenzen durch Biotin-Streptavidin-Wechelwirkung isoliert werden. Durch Amplifikation der angereicherten Sequenzen und deren erneute Umsetzung wurden bis zu 15 Selektionszyklen durchgeführt. Die Spezifität der zu katalysierenden Reaktion konnte am Reaktionsort des Linkers gezeigt werden und auf der Ebene des RNA-Pools indirekt durch Retardation des Produktes auf Polyacrylamidgelen demonstriert werden. Es wurden drei Selektionen durchgeführt. Die erste Selektion lieferte wichtige Ergebnisse für die Optimierung des Selektionsprozesses. In weiteren Selektionen wurden zum einen in einem Selektionspfad auf alle direkt durch Immobilisierung selektierten Sequenzen fokussiert, während in einem hoch stringenten Selektionspfad auch die Laserspaltung als zweites Selektionskriterium beachtet wurde. Die Anreicherung potenzieller Katalysatoren konnte gelegentlich beobachtet werden, jedoch wurde keine Anreicherung im ausreichenden Maße festgestellt. Deutliche Anzeichen einer erhöhten Aktivität konnten nicht reproduziert werden. Anstatt die selektierten Bibliotheken nach 15 Runden zu klonieren und zu sequenzieren, wurden die Selektionsbedingungen weiter analysiert, um die experimentellen Beobachtungen zu erklären. Diese Untersuchungen deuteten auf eine erhöhte Reaktivität der kurzlebigen Substrate gegenüber RNA-internen Positionen hin. Möglicherweise sind Selbstmodifizierungsreaktionen eine Erklärung für die Anreicherung während der ersten Selektion mit in situ aktivierten Reaktanden; entsprechende Experimente bekräftigen diese Annahme. Die Ergebnisse aus den Selektionsexperimenten und die nachfolgende Analyse beinhalten wertvolle Hinweise für ein zukünftiges Design von Selektionssystemen, die das Ziel verfolgen, ökologische Katalysatoren aus RNA für komplexe chemische Umsetzungen zu generieren.

Translation of abstract (English)

Ribonucleic acid (RNA) is a type of molecule with so many talents that it has been suggested that there might have been an “RNA world” in which all biologic processes were performed by these biomolecules. Important experimentally proven capabilities of RNA include the binding of a large diversity of substrates, its catalytic ribosomal contribution to protein synthesis in vivo, as well as its catalysis of chemical transformations in vitro. The exploitation of the latter feature in drug and diagnostic research has resulted in the development of tailor-made RNA-based enzymes (ribozymes) by a number of techniques. Broadening this repertoire of techniques, this thesis reports the construction, establishment, and analysis of a novel variety of selection system for the generation of ribozymes using short-living and highly reactive substrates generated in situ. An organic reaction widely used for building heterocyclic structures – the 1,3-dipolar cycloaddition – was chosen to establish the method. Combinatorial RNA libraries were screened for active molecules catalyzing the reaction between an acrylate RNA conjugate and a biotinylated nitrile oxide by using the direct selection with cleavable, linker-coupled reactants. The dipolarophile acrylate reactant was attached via a flexible dinucleotide linker to the 3´-terminus of the RNA by enzymatic ligation. A photocleavable o-nitrobenzyl moiety was positioned within this linker with a dual purpose: controlling the regioselectivity of the reaction and prevention of possible side reactions. The nitrile oxide activation occurred in situ. After reaction, the active RNA molecules could be separated from unreacted sequences by a biotin-streptavidin interaction. Up to 15 cycles of amplification of the enriched sequences and their subsequent turnover were performed. The specificity of the desired catalytic reaction could be demonstrated, both directly at the acrylate group of the linker, and indirectly on the level of the RNA pool by product retardation on polyacrylamide gels. Three selections were done. The results of the first selection were used to optimize the selection process. Further selections were separated into a low stringent path gathering all directly isolated sequences, and a high stringent path that includes the laser cleavage step as an additional selection criterion. The enrichment of potential catalysts could be observed occasionally, however no sufficient increase of reactivity was noticed. While indications of higher activity during selection were observed, these were not reproducible. Rather than cloning and sequencing the enriched pool after the 15th round of selection, the selection conditions were analyzed to explain the experimental observations. This revealed the potential of short-living and highly reactive species for RNA-internal side reactions. In consequence, self-modification reaction is a likely explanation for the enrichment during the first in vitro selections with reactants in situ activated; this has been corroborated by additional experiments. The results of the selections and their further analysis include also helpful hints for future designing of new selection systems aiming at identifying ecological RNA catalysts for complex organic reactions.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Dr. Andres
Date of thesis defense: 8 February 2006
Date Deposited: 28 Mar 2006 14:21
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: in vitro Selektion , Ribozyme , dipolare Cycloaddition , Nitriloxide , katalytische Nukleinsäurenin vitro selection , ribozymes , dipolar cycloaddition , nitril oxide , catalytic nucleic acids
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