German Title: Neue Fluoreszenzsonden für intrazelluläre Signalwege

Preview

PDF, English Download (5MB) | Terms of use

Abstract

Protein kinase C (PKC), comprised of ten isozymes, is an abundant regulator of cellular function. PKC activity in living cells is commonly assayed in in vitro experiments with cell lysate. Monitoring PKC activity in single living cells is not possible with such experiments. This thesis presents a novel fluorescent reporter for PKC activity in living cells. The kinase C probe (KCP-1) consists of a PKC specific substrate sequence that is flanked by two fluorescent proteins, which are capable of fluorescence resonance energy transfer (FRET). The substrate sequence is truncated pleckstrin, which is specifically phoshorylated by PKC between a pleckstrin homology and DEP domain. Green fluorescent protein square (GFP2) and enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) were chosen as FRET partners, because of their perfect overlap of donor emission and acceptor excitation. The probe reported PKC activity after stimulation of cells with drugs and mitogens, including phorbol ester, diacylglycerol, histamine, and bradykinin. The KCP-1 signal was reversed after cell treatment with the PKC specific inhibitor Gö6983. Stable cell lines and transgenic fly embryos which expressed KCP-1 demonstrated that the probe was not toxic to cells. Live cell or in vitro tests demonstrated KCP-1 specificity for PKC over protein kinase A (PKA), calcium/calmodulin dependent kinase (CaMKII), protein kinase B, and aurora kinases. These experiments demonstrated that KCP-1 can be used in living cells to specifically monitor PKC activity. KCP-1 was simultaneously observed in single cells with other fluorescent probes, including indicators for the PKC activators calcium and diacylglycerol. These tests demonstrated feasibility and limitations of such experiments. Furthermore, these, as well as in vitro experiments suggested that KCP-1 primarily reported activities of calcium independent PKC isozymes. One application of KCP-1 is drug-screening assays. Initial experiments with the stable cell line demonstrated that the probe can be used in such assays after further optimization of experimental parameters. Optimization of the probe involved modification of several features: KCP-1 mutants were altered in the membrane targeting PH domain. These constructs lacked residual translocation activity of this domain. The probe’s PKC substrate loop harboured three phosphate acceptor amino acids. These were mutated systematically to alanines or glutamates. Comparison of responses from the different mutants showed a) that one specific serine in KCP-1 was necessary and sufficient to produce a maximal response and b) that these three amino acids contributed differently to the FRET change. Potentially, these results can be conferred to pleckstrin, a protein of unknown function. Furthermore, KCP-1’s substrate loop was altered to extend specificity to other kinases. One of the engineered constructs responded to PKA activation. In summary, a novel FRET reporter for PKC activity was developed and its applications and limitations were tested. The probes specificity could be extended to PKA and therefore, the reporter may serve as a platform for further probe development.

Translation of abstract (German)

Protein Kinase C (PKC) umfasst zehn Isoenzyme und reguliert eine Vielzahl an zellulären Funktionen. PKC-Aktivität in Zellen wird üblicherweise durch in vitro Experimente mit Zelllysaten untersucht. Der Nachteil solcher Methode ist, dass sie keinen Aufschluss über PKC-Aktivität in einzelnen, lebenden Zellen geben kann. Die vorliegende Arbeit stellt eine neue Fluoreszenzprobe für PKC-Aktivität vor. Die Kinase C Probe (KCP-1) besteht aus einer PKC-spezifischen Substratsequenz, die von zwei fluoreszenten Proteinen flankiert wird. Fluoreszenz Resonanzenergie Transfer (FRET) zwischen den gewählten Fluorophoren ist möglich. Die Substratsequenz ist ein verkürztes Pleckstrin, ein Protein das spezifisch von PKC zwischen einer Pleckstrin-Homologie (PH) und einer DEP Domäne phosphoryliert wird. Grün-fluoreszierendes Protein (GFP2) und gelb-fluorezierendes Protein (EYFP) waren die FRET-Partner der Wahl, da bei diesen Donoremissions- und Akzeptoranregungsspektren perfekt überlappen. Die Probe zeigte PKC-Aktivität in lebenden Zellen an. Zellen wurden unter anderem mit Phorbolester, Diacylglycerol, Histamin und Bradykinin stimuliert. Das Signal wurde durch Gabe von Gö6983, einem PKC-spezifischen Inhibitor, aufgehoben. Zelllinien, die stabil mit KCP-1 transfiziert waren, und KCP-1 transgene Fliegenembryonen zeigten, dass das Protein nicht zelltoxisch war. Experimente in lebenden Zellen oder in vitro zeigten, dass KCP-1 von PKC phosphoryliert wurde, aber nicht von Protein kinase A (PKA), Kalzium/Calmodulin abhängiger kinase (CaMKII), Protein Kinase B und Aurora Kinasen. Diese Experimente demonstrieren, dass KCP-1 in lebenden Zellen verwendet werden kann um spezifisch PKC-Aktivität zu verfolgen. KCP-1 wurde parallel mit anderen Fluorezenzproben, darunter welche für die PKC-Aktivatoren Kalzium und Diacylglycerol, beobachtet. Diese Experimente zeigten Möglichkeiten und Einschränkungen solcher Untersuchungen. Außerdem legten diese, als auch in vitro Experimente nahe, dass KCP-1 vornehmlich Aktivität von kalziumunabhängigen PKC Isoformen anzeigt. Eine mögliche Anwendung von KCP-1 sind Screening-Verfahren für PKC-Inhibitoren. Vorläufige Experimente mit KCP-1-stabilen Zelllinien zeigten, dass solche Methoden prinzipiell möglich sind, aber noch weiterer Optimierung bedürfen. KCP-1 kann durch verschiedene Änderungen verbessert werden: KCP-1 wurde in der PH Domäne mutiert, welche aktiviertes Pleckstrin mit der Zellmembran assoziiert. Solche Konstrukte zeigten keine Aktivität dieser Domäne. Die Substratsequenz von KCP-1 beinhaltete drei Aminosäuren, die phosphoryliert werden können. Diese wurden systematisch zu Alaninen oder Glutamaten permutiert. Vergleiche der Signale dieser Proben zeigte, dass a) ein spezifisches Serin für eine maximalen FRET-Änderung hinreichend und notwendig war und, dass b) die drei Aminosäuren unterschiedlich stark zur FRET-Änderung beitrugen. Möglicherweise sind diese Ergebnisse auf Pleckstrin übertragbar, einem Protein mit unbekannter Funktion. Des Weiteren wurde die Substratsequenz von KCP-1 mutiert, so dass die Kinasespezifität entweder geändert oder erweitert wurde. Eines dieser Konstrukte zeigte Signale nach Aktivierung von PKA. Zusammengefasst, wurde mit KCP-1 eine neue FRET-Probe für PKC-Aktivität entwickelt und deren Möglichkeiten und Limitationen getestet. Die Spezifität der Probe konnte von PKC auf PKA ausgedehnt werden und lässt damit hoffen, dass KCP-1 eine allgemeine Plattform für weitere Probenentwicklung darstellen könnte.