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Quantitative Measurements of Force Distribution in Single and Multi Cellular Systems

Ulmer, Jens

German Title: Quantitative Messung der Kräfteverteilung in Einzel und Vielzelligen Systemen

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Abstract

Tissue formation and organ development in animals is a complex, lifelong process. The building blocks of tissue are living cells surrounded by secretion products, mostly proteins and polysaccharides. Aggregates of these proteins have different structural geometries and functionalities depending on localization and task in vivo. They form the extracellular matrix (ECM). The detailed quantitative evaluation of tissue construction and tissue-cell interaction is essential for a detailed understanding of organ development and its associated malfunctions which lead to different diseases. However, quantitative studies of cellular events in vivo are restricted since high resolution techniques characterizing cell functions are not suitable for living organism. In respect to tissue culture techniques, introduction of artefacts in mammalian cells cultured on flat, rigid and non-natural two dimensional surfaces is apparent. Such surfaces do not possess three dimensionality and variation of compliance on the micrometer scale as observed in the ECM. To circumvent this drawback new materials and techniques are needed, where surface compliance, structural geometry and chemical composition of ECM models can be adjusted independently. In addition, local force and compliance measurements should produce new insights in cell-ECM interaction and tissue development. The first two parts of this thesis describe a novel micro-engineered mechanical device which serves as a platform for constructing ECM models and as force sensor array. We developed a transparent elastic surface with arrays of micrometer scaled posts. The development process is based on standard photolithographic techniques. Typical structural dimensions of posts are a diameter of 2.5 micro m a height of 15 micro m. Physical properties of post arrays such as local and macroscopic substrate elasticity were investigated quantitatively. These posts were shown to be able to serve as a quantitative device measuring local forces down to the nanonewton range implied by the calibration analysis. The micro-array offers a template for constructing the ECM in vitro with different chemical and mechanical constitutions of the ECM as well as different geometries. The tops of posts were selectively functionalized with either a peptide sequences (arginine-glycine-aspartate, cRGD) or an amorphous matrix protein resulting in well defined surfaces suitable for quantitative force measurements of living cells. By exploring the impact of surface tension of air-water interfaces from protein solution in close contact with a micro-array, the force dependence of fibronectin fibre formation was shown. Part III describes the application of force sensor arrays for measuring an adherent cell’s spatial distribution of local forces along its membrane. Therefore rat embryonic fibroblasts with GFP fusion proteins to paxilin and beta3 integrin were used to localize the focal adhesions with fluorescence microscopy under physiological conditions. Correlation of patch size to generated force revealed local stress values from 0.1 ± 1.5 up to 115 ± 15.1 nN/micro m2 as a function of cell-state. Using surfaces with different pliabilities by variation of post height and chemical functionality, it was possible to investigate different morphological states of adhesion sites in human foreskin fibroblasts (HFF). The molecular composition of focal contacts strongly depends not only on local substrate stiffness but also on the global compliance of the surface. In the case of fibronectin coated microarrays development of focal contacts was strongly dependent on stiffness of the underlying support. However, post arrays with different compliance and coated with cRGD demonstrated that local mechanosensing capabilities of focal contacts is also assisted by different mechanisms which sense global mechanical properties of cell’s environment. The mechanical interplay in a multicellular system was investigated in the last part of this work. During organ development cells aggregate and form multicellular compartments in a very precise manner. In order to maintain regular organ function it is important that cell can communicate during organogenesis. The communication pathways based on biochemical signalling have been extensively investigated over the past twenty years. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells form functional cellular aggregates, termed cysts under special conditions in vitro. The conditions were adapted to induce cyst growth on force sensor arrays allowing precise force mapping during cyst development. These data were analysed to verify a computational model calculating of surface-forces generated by MDCK cysts inside a 3 dimensional cell culture system. Switching to a mechanical anisotropic environment meant that MDCK cysts no longer grew as round spheres. Instead cell aggregates generated tubular shapes. So far, tubulogenesis in vitro was only inducible by adding growth factors to the culture medium.

Translation of abstract (German)

Der Aufbau von Gewebe in Säugetieren ist ein komplexer Prozess, der nicht nur während der embryonalen Phase stattfindet, sondern das ganze Leben hindurch anhält. Das Gewebe besteht grundsätzlich aus vielen komplexen Bausteinen, wie beispielsweise aus lebenden Zellen, welche in eine Faserproteinenmatrix eingebettet sind. Die Architektur der Fasermatrix weist dabei unterschiedliche Gestalt und Funktion auf. Die Architektur hängt wiederum von der Aufgabe und der Lokalisierung im Organismus ab. Für die quantitative Untersuchung von zellulären Funktionen in vivo sind die heutzutage vorhandenen Untersuchungsmethoden völlig unzureichend. In Bezug auf die allgemeine Zellkultur Techniken, bei denen Säugetierzellen auf flachen, festen zwei dimensionalen Oberflächen kultiviert werden, sind Artefakte bezüglich des Verhaltens von Zellen im Verglich mit dem Verhalten in vivo klar erkennbar. Diese Oberflächen ermöglichen keine dreidimensionale zelluläre Umgebung und zeigen auf der Mikrometerskala keine Veränderung der Oberflächenfestigkeit, wie sie in vivo für die EZM charakteristisch sind. Dadurch wird die Entwicklung neuer Techniken notwendig, bei der Festigkeit, Strukturumgebung und chemische Eigenschaften individuell und unabhängig voneinander angepasst werden können. Die ersten beiden Teile dieser Arbeit befassen sich mit der Beschreibung einer neuartigen mikromechanischen Systemtechnik. Diese besteht aus einer transparenten Oberfläche, dekoriert mit einem Säulenmuster im Mikrometermaßstab. Typische Strukturgrößen der Säulen betrugen 2,5 microns im Durchmesser und 15 microns in der Höhe. Die physikalischen Eigenschaften der Säulenmuster, wie Oberflächensteifigkeit und Benetzbarkeit mit einer Flüssigkeit, wurden quantitativ untersucht. Diese Säulen dienen als quantitative Messsonden um lokale Kräfte im Nanonewtonbereich zu messen. Zudem dient das vorgestellte mikroskopische Säulenfeld als Matrize zum Nachbau der EZM in vitro mit unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung, Architektur und Strukturgröße. Hierzu wurden zum einen die Köpfe der Säulen selektiv mit einer Peptidsequenz (Arginine-Glycine-Aspartate, cRGD) oder zum anderen mit einem amorphen Matrixprotein beschichtet, um so definierte Oberflächen für die quantitative Kraftmessung an lebenden Zellen zu erhalten. Es wurde der Einfluss der Oberflächenspannung an der Luft-Wasser Grenzfläche von Proteinlösungen, die in Kontakt mit den Spitzen der Säulenstrukturen standen, untersucht. Im dritten Teil der Arbeit wird die Anwendung der Kraftsensoren für die Messung lokaler Kräfte adhärenter Zellen beschrieben. Hierfür wurden embryonale Fibroblasten von Ratten, welche entweder ein GFP-Paxilin oder ein GFP-beta3 Fusionsprotein exprimieren, eingesetzt, um die Fokaladhäsion an lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Die Korrelation zwischen der Größe von fokalen Adhäsionsflächen und der erzeugten Kraft ergab eine Spannung von 0.1 ± 1.5 bis 115 ± 15.1 nN/microns2 als Funktion des Zustandes der Zelle. Die Verwendung von Oberflächen unterschiedlicher Festigkeit und der chemischen Funktionalität, war es möglich, verschiedene morphologische Zustände der Adhäsionspunkte in humanen Fibroblasten zu unterscheiden. Die molekulare Zusammensetzung des Proteinclusters der fokalen Adhäsion ist nicht nur abhängig von lokal an die Zellmembran angreifende Kraft sondern auch von der makroskopischen Festigkeit des Substrats. Im Falle von mit Fibronektin beschichteten Säulensubstraten war die Entwicklung der Fokaladhäsion stark von der Steifheit des unterliegenden Materials abhängig. Die Verwendung von RGD beschichteten Säulensubstraten unterschiedlicher Festigkeiten zeigte, dass die lokale mechanosensitiven Eigenschaften der Fokaladhäsion durch einen unabhängigen Mechanismus, welcher die globalen mechanischen Eigenschaften der Zellumgebung bestimmt, unterstützt wird. Die mechanische Wechselwirkung eines multizellulären Systems wurde im letzten Teil der Arbeit untersucht. Während der Organentwicklung lagern sich Zellen zu Gruppen zusammen und bilden multizelluläre Einheiten in einer strukturell sehr definierten Art und Weise. Aber nur wenig ist über den mechanischen Signalweg zwischen Zellen in multizellulären Aggregaten bekannt. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen bilden unter bestimmten Bedingungen in vitro funktionale Aggregate, so genannte Zysten. Damit wurde die auftretende Kraftverteilung während der Zystenentwicklung präzise dargestellt. Diese Daten wurden dazu verwendet, um ein computergeneriertes Model der Kraftverteilung an MDCK-Zysten innerhalb eines 3D Zellkultur-Systems zu verifizieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass unter Verwendung einer strukturell und mechanisch nicht isotropen Umgebung das Zystenwachstum nachhaltig beeinflusst wird. Die normalerweise rund wachsenden Zysten zeigten auf anisotropen Säulensubstraten eine schlauchartige Geometrie, welche bis dahin nur unter Verwendung von Wachstumsfaktoren induziert werden konnte.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Joachim
Date of thesis defense: 11 July 2005
Date Deposited: 31 May 2006 10:31
Date: 2005
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Zelladhäsion, Kraftsensor, Fibronectin
Uncontrolled Keywords: force sensor , biofunctionalization , extracellular matrix , cell adhesion , cytogenesis
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