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A Functional Genomics Approach to the Plant Soluble Pyrophosphatase Family

Ergen, Zahide Neslihan

German Title: Ein Funktioneller Genomik-Ansatz der Gen-Familie von Löslichen Pyrophosphatasen in Pflanzen

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Abstract

Although the activities of soluble pyrophosphatases were shown to be essential for a number of prokaryotes and eukaryotes, plants were assumed to lack cytoplasmic soluble pyrophosphatase activity and vacuolar membrane bound proton-pumping pyrophosphatase was accepted as the only enzyme responsible for the removal of pyrophosphate accumulated in the cytosol as a by-product of several biosynthetic pathways. On the contrary, Arabidopsis thaliana genome encodes six soluble pyrophosphatase isoforms (ASP1, ASP2A, ASP2B, ASP3, ASP4 and ASP5), which were shown to be highly conserved both in nucleic and in amino acid sequences. Microscopic analysis of leaves transiently transformed with C-terminal GFP tagged A. thaliana sPPase proteins revealed localization in the cytoplasm and/or nucleus for five isoforms (ASP1 to ASP4) and the in vivo plastidial localization of ASP5 could be shown. The analysis of stably transformed plants with promoter driven GUS expression revealed both tissue-specificity and developmental stage dependency of transcription for each A. thaliana soluble pyrophosphatase isoform. The promoter data were further confirmed by real time PCR analysis through which the active transcription of several A. thaliana soluble pyrophosphatase isoforms could be shown in all plant tissues, including later stages of development. The regulation of the expression of A. thaliana soluble pyrophosphatases by soluble sugars was analyzed using A. thaliana cell cultures and an in planta approach. A specific induction of the expression of ASP2B in response to sugar starvation was observed. Furthermore, the results indicate the possibility of sucrose regulation of the expression of ASP3, while the transcription of plastidial isoform (ASP5) was induced in response to 100 mM glucose in planta. The changes in the expression of A. thaliana soluble pyrophosphatases in response to ABA and different environmental stresses were analyzed using real time PCR. The data revealed an isoform- and/or tissue-specific and time dependent stress response suggesting specific roles for each isoform in vivo. Based on the data, the possible role of ASP3 in regulation of UGPase activity could be proposed. The wounding experiments using sugar beet (Beta vulgaris) plants overexpressing either Bsp1 (Beta vulgaris soluble pyrophosphatase isoform 1) or Bvp1 (Beta vulgaris vacuolar pyrophosphatase isoform 1) revealed the possibility of post-transcriptional regulation of mRNA levels of both soluble and vacuolar pyrophosphatases. Using recombinant Bsp1 protein expressed in Escherichia coli, the in vitro phosphorylation by protein kinase C could be shown and the possibility of post-translational regulation of plant soluble pyrophosphatase activity by phosphorylation was discussed. The overexpression of neither Bsp1 nor Bvp1 caused a significant effect on the sucrose accumulation of sugar beet taproots. On the other hand, the heterologous overexpression of not only Bvp1 but also Bsp1 revealed an impaired root growth and a possible contribution to the salt tolerance of A. thaliana. In summary, the results suggest that the plant soluble pyrophosphatases can perform multiple and vital functions during plant development and stress responses. In addition, the expression patterns of plant soluble pyrophosphatases indicate a strong link to the plant carbohydrate metabolism.

Translation of abstract (German)

Obwohl die Aktivität löslicher Pyrophosphatasen (sPPasen) essentiell für eine Reihe von Pro- und Eukaryonten ist, wurde für Pflanzen lange Zeit angenommen, dass sie keine im Zytosol löslichen Pyrophosphatasen besitzen und die membran-gebundene Protonen-transportierende vakuoläre Pyrophosphatase das einzige Enzym ist, welches das als Nebenprodukt verschiedener Biosynthesewege anfallende Pyrophosphat im Zytosol beseitigen könnte. Allerdings finden sich im Genom von Arabidopsis thaliana sechs lösliche Pyrophosphatase-Isoformen (ASP1, ASP2A, ASP2B, ASP3, ASP4 und ASP5), welche sowohl auf Nukleinsäure- als auch auf Aminosäure-Ebene hoch konserviert sind. Die mikroskopische Analyse von Blätten, welche transient mit C-terminalem GFP-Fusionsprotein der Arabidopsis sPPasen transformiert wurden, zeigt dass fünf Isoformen (ASP1-ASP4) im Zytoplasma und/oder dem Kern und eine Isoform (ASP5) in den Plastiden vorkommen. Durch Analyse von stabil mit Promotor:GUS-Konstrukten transformierten Pflanzen lässt sich die Gewebs-spezifische und entwicklungsabhängige Transkription für jede sPPase aus A. thaliana zeigen. Diese Daten werden unterstützt durch eine quantitative "real time PCR"-Analyse, über die Transkripte der verschiedenen sPPase-Isoformen in allen untersuchten Pflanzenorganen (auch in späten Entwicklungsstadien) nachgewiesen werden konnten. Die Regulation der Expression von sPPasen aus A. thaliana durch lösliche Zucker wurde mit Hilfe von Arabidopsis-Zellkulturen und einem in planta-Ansatz untersucht. Dabei zeigte sich, dass ASP2B spezifisch durch Zucker-Mangel induziert wird. Außerdem deuten die Ergebnisse auf eine mögliche Saccharose-Regulation der Expression von ASP3, während die Transkription der plastidären Isoform (ASP5) in planta durch 100mM Glukose induziert wird. Mittels "real time PCR" wurden auch Änderungen in der Expression der A. thaliana sPPasen in Antwort auf ABA und unterschiedliche Stresssituationen analysiert. Die Ergebnisse zeigen sowohl eine Isoform- und Gewebe-spezifische als auch eine zeitabhängige Stress-Antwort, was eine spezifische Rolle jeder einzelnen Isoform in vivo nahe legt. Anhand der Daten lässt sich eine mögliche Rolle der ASP3-Isoform, reguliert durch die Aktivität der UGPase, vorschlagen. Verwundungsexperimente mit Zuckerrüben-Pflanzen (Beta vulgaris) die entweder Bsp1 (Beta vulgaris soluble pyrophosphatase isoform 1) oder Bvp1 (Beta vulgaris vacuolar pyrophosphatase isoform 1) überexprimieren zeigen die Möglichkeit der post-transkriptionalen Regulation der mRNA-Mengen von beiden Genen. Rekombinant in Escherichia coli hergestelltes BSP1-Protein wird in vitro durch Protein Kinase C phosphoryliert und die mögliche post-translationale Regulation löslicher Pyrophosphatase-Aktivität durch Phosphosylierung wird diskutiert. Weder die Überexpression von Bsp1 noch von Bvp1 führte zu einem signifikanten Effekt auf die Saccharose-Akkumulation in Zuckerrüben-Speicherwurzeln. Auf der anderen Seite führte die heterologe Expression von Bvp1 und auch von Bsp1 zu einem veränderten Wurzelwachstum und möglicherweise zu veränderter Salztoleranz in A. thaliana. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse vielfältige und lebenswichtige Funktionen pflanzlicher, löslicher Pyrophosphatasen während der Entwicklung und während Stressantworten nahe legen. Außerdem deuten die Expressionsmuster der löslichen Pyrophosphatasen auf eine starke Vernetzung mit dem pflanzlichen Kohlenhydrat-Metabolismus.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rausch, Prof.Dr. Thomas
Date of thesis defense: 8. June 2006
Date Deposited: 20. Jun 2006 14:10
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Soluble pyrophosphatases , Arabidopsis thaliana , Beta vulgaris , Functional genomics
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