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The Role of PGRP Proteins in Innate Immunity Pathways in the Malaria Vector Anopheles gambiae

Meister, Stephan

German Title: Die Rolle der PGRP Proteine in Signalkaskaden der angeborenen Immunität im Malaria Vektor Anopheles gambiae

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Abstract

Innate immunity is the first line of defense against invading microorganisms and provides clues to adaptive immunity for the development of memory for subsequent infections. Insects, similar to other invertebrates, do not have adaptive immunity and thus rely on their innate immune system to combat infections. We have analyzed the role of the peptidoglycan (PGN) receptor protein (PGRP) family and other components of innate immune signaling pathways in the immune defense of the mosquito Anopheles gambiae, the main vector of human malaria in sub-Saharan Africa. The PGRP gene family consists of seven genes with ten PGRP domains. We have shown that from all PGRP genes only PGRPLC has a role in the resistance to bacterial infections of both Gram types. In our experiments we have used the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus and the Gram-negative bacterium Escherichia coli. The PGRPLC gene encodes at least three isoforms that derive from infection-driven alternative splicing of a pool of immature transcripts. Each isoform contains a different PGRP domain, encoded by three exons that all contribute equally to the PGN binding pocket. Structural modeling of the PGRPLC isoforms revealed a potential for all isoforms to bind both types of PGN, the Lys-type, which is mostly found in Gram-positive bacteria and the DAP-type, mostly found in Gram-negative bacteria. The isoform PGRPLC3 seems to be the most important in the defense against both bacteria species, although PGRPLC1 also has a crucial role in the defense against S. aureus. Bacterial defense is mediated by the NF-κB transcription factor REL2, which is the ortholog of the Drosophila Relish. The REL2 gene also encodes two protein isoforms: REL2-S, which only has the NF-κB domain, and REL2-F, which carries an I-κB inhibitory domain and a death domain in addition. REL2-F functions together with the receptor adaptor protein IMD to deal with S. aureus infections, whereas REL2-S has a role in the defense against E. coli. The PGRPLC/IMD/REL2-F pathway (IMD) is also partly responsible for the losses of Plasmodium berghei, which can be observed during the first stages of malaria infection of A. gambiae. P. berghei is a rodent malaria parasite, which has been used as a model in our studies. Whether the pathway is able to recognize the malaria parasite through PGRPLC or another associated receptor is still unclear. Another possibility is that the pathway is activated by the proliferation of commensal bacteria in the mosquito gut following a blood meal. However, we have shown that more than one of the three main isoforms of PGRPLC are required for the reaction to P. berghei. Other PGRP genes, which have been proven to play a role during infection with P. berghei, are PGRPLA2, which also mediates parasite killing, and the almost identical and thus hardly indistinguishable PGRPS2 and S3, which appear to inhibit parasite killing. This is possibly achieved by negative regulation of the IMD pathway through sequestration of PGN, which derives from the commensal bacteria and constitutively activates the pathway. We have shown that REL1, the second NF-κB transcription factor of A. gambiae, which is orthologous to the Drosophila Dorsal (Dif does not exist in Anopheles), is not involved in the mosquito resistance to bacterial infections. This fact provides additional evidence that the REL2-associated pathways are of utmost importance in the A. gambiae defense to bacteria. In addition, REL1 has no role in the documented P. berghei killing. However, silencing of the REL1 inhibitor CACT (the ortholog of the Drosophila Cactus) during a parasite infection leads to a very strong refractoriness phenotype: most of the midgut-invading ookinetes are eliminated (presumably by lysis) and the remaining of the ookinetes are melanized. We thus assume that under wild-type infection conditions the parasite is either evading recognition by the REL1-associated receptors or actively modulating activation of REL1. In conclusion, the data reported in this PhD thesis suggest significant divergence of immune signaling between the mosquito A. gambiae and the fruit fly D. melanogaster. The observed differences most likely reflect their different lifestyles and, consequently, different infectious agents, which the two insects encountered during their evolutionary lifetimes. In mosquitoes one of these agents is the malaria parasite.

Translation of abstract (German)

Angeborene Immunität ist die primäre Verteidigungsstrategie gegen eindringende Mikroorganismen und liefert dem adaptiven Immunsystem Signale für die Entwicklung von Gedächniszellen für nachfolgende Infektionen. Ähnlich wie andere Invertebraten, verfügen Insekten nicht über eine adaptive Immunreaktion und verlassen sich deshalb voll auf ihr angeborenes Immunsystem, um Infektionen zu bekämpfen. Wir haben analysiert, welche Rolle die Familie der Peptidoglycan (PGN) Rezeptor Proteine (PGRP) und andere Komponenten der angeborenen Immunsignalkaskaden bei der Immunantwort des Moskitos Anopheles gambiae spielen. A. gambiae ist der Hauptüberträger der menschlichen Malaria im südlich der Sahara gelegenen Teil Afrikas. Die Genfamilie der PGRPs besteht aus sieben Genen mit zehn PGRP Domänen. Wir konnten zeigen, dass von allen PGRP Genen nur PGRPLC eine Rolle in der Verteidigung gegen bakterielle Infektionen, egal welchen Gramtyps, spielt. In unseren Experimenten haben wir das grampositive Bakterium Staphylococcus aureus und das gramnegative Bakterium Escherichia coli benutzt. Das PGRPLC Gen kodiert mindestens 3 Isoformen, die – je nach Infektion – aus einem Pool von unreifen Transkripten durch alternatives Splicing gebildet werden. Jede Isoform hat eine andere PGRP Domäne, welche jeweils von drei Exons kodiert wird, die alle gleich viel zur PGN Erkennungstasche beitragen. Strukturelle Modelle von PGRPLC zeigten, dass alle Isoformen dazu in der Lage sind, beide Arten von PGN zu binden, wobei die Lys-Form hauptsächlich in grampositiven Bakterien und die DAP-Form hauptsächlich in gramnegativen Bakterien vorkommt. Die PGRPLC3 Isoform scheint die wichtigste Rolle bei der Verteidigung gegen die beiden bakteriellen Formen zu haben, obwohl PGRPLC1 auch eine wichtige Rolle bei der Verteidigung gegen S. aureus zu spielen scheint. Die Verteidigung gegen Bakterien wird von dem NF-κB Transkriptionsfaktor REL2 bewerkstelligt, welcher das Ortholog des Drosophila Relish Gens ist. Das REL2 Gen kodiert zwei Protein Isoformen: REL2-S, das lediglich die NF-κB Domäne hat, und REL2-F, das zusätzlich noch eine inhibierende I-κB und eine Death Domäne hat. REL2-F arbeitet mit dem Rezeptor-Adaptor Protein IMD zusammen, um S. aureus Infektionen zu bekämpfen, wogegen REL2-S eine Rolle in der Verteidigung gegen E. coli spielt. Die PGRPLC/IMD/REL2-F Signalkaskade (IMD) ist auch teilweise verantwortlich für die Verluste, die Plasmodium berghei, ein Nager Malariaparasit, während der ersten Stadien der Malaria Infektion in A.gambiae erleidet. Dieser Malariaparasit ist als Modelsystem für unsere Studien verwendet worden. Ob die IMD Signalkaskade auch fähig ist, den Malariaparasiten direkt durch PGRPLC oder einen anderen beteiligten Rezeptor zu erkennen, ist immer noch unklar. Nach einer Blutmahlzeit vermehren sich die residenten Bakterien im Moskitodarm. Es ist durchaus möglich, dass die Signalkaskade dadurch aktiviert wird. Unabhängig davon, konnten wir zeigen, dass mehr als eine der drei PGRPLC Isoformen benötigt werden, um eine Reaktion auf P. berghei hervorzurufen. Weitere PGRP Gene, die nachweislich eine Rolle während der Infektion mit P. berghei spielen, sind PGRPLA2 und PGRPS2 und S3. PGRPLA2 begünstigt den Kampf gegen den Parasiten, während PGRPS2 und S3, die nahezu identisch und deshalb kaum zu unterscheiden sind, den Kampf gegen den Parasiten zu behindern scheinen. Letzteres könnte durch Sequestration des PGN der residenten Bakterien erreicht werden, welches zu einer Inhibierung der IMD Signalkaskade führen würde. Wir haben gezeigt, dass der zweite NF-κB Transkriptionsfaktor in A. gambiae, REL1, der ein Ortholog des Drosophila Dorsal ist (Dif existiert nicht in Anopheles), nicht in der Moskito Verteidigung gegen bakterielle Infektionen involviert ist. Dieser Umstand beweist noch einmal mehr, welche große Bedeutung den REL2 Signalkaskaden in A. gambiae im Kampf gegen die Bakterien zukommt. Zudem scheint REL1 keine Rolle in der Verteidigung gegen P. berghei zu spielen. Setzt man jedoch den REL1 Inhibitor CACT (das Ortholog des Drosophila Cactus) während einer Malaria Infektion außer Kraft, so kommt es zu einem sehr stark refraktorischen Phenotypus: Die meisten der Ookineten, die versuchen in den Moskito Mitteldarm einzudringen, werden eliminiert (vermutlich lysiert) und die restlichen Ookineten werden melanisiert. Wir vermuten, dass unter den Bedingungen einer natürlich hervorgerufenen Infektion der Parasit entweder die Erkennung durch die Rezeptoren der REL1 Signalkaskade vermeidet oder aber gezielt die Aktivierung von REL1 verhindert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Daten, die in dieser Doktorarbeit angeführt werden, eine signifikante Abweichung der Signalkaskaden des Moskito A. gambiae von denen der Fruchtfliege D. melanogaster beschreiben. Die beobachteten Unterschiede lassen sich wahrscheinlich auf die unterschiedlichen Lebensumstände und infektiösen Organismen zurückführen, denen diese zwei Insekten während ihrer Evolution ausgesetzt waren. Für den Moskito war einer dieser Organismen der Malaria Parasit.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kafatos, Professor Fotis C.
Date of thesis defense: 19. October 2006
Date Deposited: 02. Nov 2006 12:57
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Malaria, Angeborene Immunität, Anopheles gambiae, Plasmodium, Plasmodium berghei, Microarray, RNS-Interferenz
Uncontrolled Keywords: PGRP , Toll Pathway , Imd Pathway
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