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Regulation of taproot development and sucrose stabilization in sugar beet: Influence of invertase inhibitors and occurrence of mitochondrial energy-dissipating proteins

Eufinger, Jan Dominik

German Title: Regulation der Saccharoseakkumulation und -stabilisierung in der Zuckerrübe: Einfluss von Invertaseinhibitoren und Auftreten von mitochondriellen, Energieüberschuss-abbauenden Proteinen

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Abstract

Die Zuckerrübe (Beta vulgaris) ist eine der wenigen Pflanzen, die große Mengen Saccharose speichert. Während der Entwicklung der Speicherwurzel akkumuliert Saccharose in den Vakuolen und kann in modernen Sorten einen Anteil von bis zu 20 % des Frischgewichtes erreichen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der wichtigsten Saccharose-spaltenden Enzyme bestimmt. Die Aktivität von Invertasen zeigt eine negative Korrelation zur Saccharoseanreicherung und während des Großteils der Speicherwurzelentwicklung werden lediglich Isoformen der Saccharose-Synthase und keine Invertasen exprimiert. Nach Verwundung werden eine Zellwand-lokalisierte und eine vakuolären Invertase induziert, wobei letztere für einen großen Teil der Saccharoseverluste nach der Ernte verantwortlich ist. Versuche die Aktivität dieser vakuolären Invertase durch Überexpression eines Invertaseinhibitors aus Tabak zu unterbinden erbrachten keine Verringerung der wundinduzierten Saccharosehydrolyse. Ein endogener Invertaseinhibitor der Zuckerrübe, BvC/VIF1 (Beta vulgaris cell wall or vacuolar inhibitor of beta-fructosidase), wurde identifiziert und funktionell charakterisiert. Der Inhibitor zeigt eine starke Expression während der Speicherrübenentwicklung und das rekombinant hergestellte BvC/VIF1-Protein zeigt eine hohe Affinität zu sauren Invertasen, insbesondere zu vakuolären Invertasen. Um mehr über die physiologische Rolle des Inhibitors während der Entwicklung der Zuckerrübenspeicherwurzel herauszufinden, wurde Versuche zur Verringerung der Expression dieses Gens unternommen. Außerdem wurden Zuckerrübenpflanzen hergestellt, die BvC/VIF1 vermehrt exprimieren. Erste Untersuchungen an diesen Pflanzen zeigten, dass es hierdurch zu einer signifikanten Verringerung der vakuolären Invertaseaktivität in Blättern kommt. Mittels eines gegen das BvC/VIF1-Protein erstelltem Antiserums wurden zwei Inhibitorproteine in Speicherwurzelextrakten nachgewiesen. Dahingegen trat in der Zellwand von Beta vulgaris Suspensionskulturzellen nur ein Protein auf. Von diesen drei Proteinen wurden partielle Peptidsequenzen ermittelt, die mit der bekannten BvC/VIF1-Sequenz übereinstimmten. In Blättern von transgenen, BvC/VIF1 überexprimierenden, Pflanzen wurden zwei Proteine beobachtet, die eine ähnliche Größe zeigen wie die in untransformierten Speicherwurzeln beobachteten und die in Blättern von Wildtyppflanzen nicht vorhanden sind. Dies deutet daraufhin, dass möglicherweise Proteine mit unterschiedlichen Größen durch die Translation eines einzelnen BvC/VIF1-Gens entstehen. Die subzelluläre Lokalisierung der Inhibitorproteine wurde mittels GFP-Fusionen analysiert. Die Fusionsproteine wurden entweder in der Vakuole beobachtet, was auf das Vorhandensein von vakuolären Sortierungssignalen hindeutet, oder aggregierten in Vesikel-artigen Strukturen. Weiterhin trat eine proteolytische Spaltung von Inhibitor-GFP Fusionen auf, die zum Nachweis von freiem Inhibitorprotein führte. Mittels differentieller Extraktion aus untransformierten Speicherwurzeln und Suspensionskulturzellen konnte gezeigt werden, dass das kleinere der beiden Inhibitorproteine in der Zellwand lokalisiert zu sein scheint. Um die Wechselwirkung zwischen Invertase und Inhibitor genauer zu untersuchen, wurde eine Zuckerrüben-Invertase rekombinant in Bakterien hergestellt und ihre enzymatischen Eigenschaften untersucht. Der Km-Wert der Invertase liegt im unteren millimolaren Bereich und das Enzym zeigt eine maximale Aktivität zwischen pH 4 und 6. Die Wechselwirkung mit dem Invertaseinhibitor ist ebenfalls in hohem Maße pH-abhängig und zeigt ein Maximum zwischen pH 4 und 5. Oberhalb von pH 6 kommt es zu keiner Bindung des Inhibitors an die Invertase. Da die pH-Bedingungen von zellulären Kompartimenten wie der Zellwand oder der Vakuole dynamischen Schwankungen unterliegen, handelt es sich hierbei möglicherweise um einen Regulationsmechanismus der Invertaseinaktivierung. In einem zweiten Projekt wurden erste Ergebnisse über das Vorhandensein und die Regulation von Proteinen, die die Effizienz der Atmung regulieren erzielt. Zwei Isoformen von sogenannten Uncoupling Proteinen werden konstitutiv in der Zuckerrübe exprimiert, während eine Induktion einer alternativen Oxidase nach Verwundung und Lagerung beobachtet wurde. Mitglieder beider Genfamilien sind mögliche Zielgene, die Saccharoseverluste während der Lagerung beeinflussen können. Sie dienen als Energie-Ableitungssysteme und ihre Aktivität kann die Respiration erhöhen, was einen vermehrten Saccharoseabbau zur Folge hat. Die ermittelten Ergebnisse weisen daraufhin, dass zumindest die alternative Oxidase eine starke Reaktion auf Verwundung und Lagerung zeigt.

Translation of abstract (English)

Sugar beet (Beta vulgaris) is one of the few plants storing large amounts of sucrose. During the development of its large taproot, sucrose is accumulated inside the vacuoles, reaching concentrations of up to 20 % (w/w) in modern cultivars. In the course of this study, the expression of the major sucrolytic enzymes in sugar beet was determined. Invertase activity is negatively correlated with sucrose accumulation and during the major part of taproot development, only sucrose synthase isoforms and no acid invertases are expressed. After wounding, a cell wall and a vacuolar invertase are induced, of which the latter is of high importance for post-harvest sucrose losses. Efforts to silence this vacuolar invertase by overexpression of an invertase inhibitor from tobacco did not lead to a reduction of the wound-induced sucrose hydrolysis. An endogenous invertase inhibitor of sugar beet, BvC/VIF1 (Beta vulgaris) cell wall or vacuolar inhibitor of beta-fructosidase), was identified and functionally characterized. It is strongly expressed during taproot development and the recombinantly produced BvC/VIF1 protein has a strong affinity against acid invertases, especially against vacuolar invertases. In order elucidate the pyhsiological role of the inhibitor during taproot development, a transgenic approach to silence its expression was initiated. Furthermore, sugar beet plants overexpressing BvC/VIF1 have been generated and first tests with these plants have shown a significant reduction of vacuolar invertase activity in leaves. With an antiserum raised against the BvC/VIF1 protein, two inhibitor proteins are detected in extracts from taproots, whereas in the cell wall of Beta vulgaris suspension culture cells only one protein is found. For all three proteins, partial peptide sequences were identified, which matched the known BvC/VIF1 sequence. In leaves of transgenic sugar beet plants overexpressing BvC/VIF1, but not in leaves of wildtype plants, two proteins of a similar size as observed in untransformed taproots were detected, suggesting that proteins of deviating size may arise from the translation of a single BvC/VIF1 gene. The subcellular localization of the inhibitor proteins was studied using GFP fusions. The fusion proteins appeared either in the vacuole, indicating the presence of vacuolar sorting signals in the BvC/VIF1 sequence, or aggregated in vesicle-like structures. Furthermore, a proteolytic cleavage of the inhibitor-GFP fusion occurred, leading to the presence of free inhibitor protein. In untransformed cells, the smaller of the two inhibitor proteins seems to be localized in the cell wall, as was deduced from differential extraction from taproots and suspension culture cells. The interaction between invertases and inhibitors has been studied in detail. Therefore, a sugar beet invertase was produced recombinantly in bacteria and its enzymatic characteristics were studied. The Km-value of the invertase is in the low millimolar range and it shows a maximal activity between pH 4 and 6. The interaction with the invertase inhibitor is also strongly pH dependent, showing maximum inhibition between pH 4 and 5. No inhibition and binding of the inhibitor was observed above pH 6. Since pH values in cellular compartments like the cell wall or the vacuole underly dynamic changes, this leaves open a potential regulatory mechanism of the invertase inactivation. In a second project, first results about the presence and regulation of proteins regulating the efficiency of respiration have been obtained. Whereas two identified isoforms of uncoupling proteins are constitutively expressed in sugar beet, an induction of alternative oxidase proteins during wounding and storage was observed. Members of both gene families are potential target genes, which may influence sucrose losses during post-harvest storage. They serve as energy-dissipating systems and their activity can increase respiration rates and concomitantly sucrose breakdown. The obtained results provide first evidence, that at least the alternative oxidase shows a strong response to wounding and storage.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rausch, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 21 June 2006
Date Deposited: 30 Jun 2006 09:41
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Invertase, Zuckerrübe, Posttranslationale Änderung, Saccharosesynthase, Saccharosestoffwechsel, Inhibitorproteine, Enzyminhibitor
Uncontrolled Keywords: Invertase-Inhibitor , Saccharoseverluste , Beta vulgarisinvertase-inhibitor , Post-harvest-metabolism , sugar beet , Beta vulgaris , posttranslational regulation
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