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Quantitative Analysis of the Structural Dynamics of Mitotic Chromosomes in Live Mammalian Cells

Mora-Bermúdez, Felipe

German Title: Quantitativ Analyse der Strukturelle Dynamik Mitotischer Chromosomen in Lebenden Säugerzellen

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Abstract

Chromatin, organized into individual chromosomes, is the physiological carrier of the genetic and epigenetic information in eukaryotes. In the nucleus of an intact cell, the structure of chromatin is dynamic and essential for genomic activities. The most dramatic changes in chromatin structure occur in mitosis, when compact metaphase chromosomes are formed, organized and partitioned equally to two daughter cells. How this vital reorganization of chromatin is accomplished remains poorly understood in vivo. To address this, in the first part of my thesis I developed quantitative assays to determine the kinetics of mitotic chromosome compaction, using multidimensional confocal microscopy of live cells stably expressing fluorescent histone 2b. Condensation was measured at three different scales: Large-scale (~800 nm), where the chromatin volume was measured by high resolution 4D imaging; medium scale (~200 nm) by statistical analysis of pixel intensities; and molecular scale (~10 nm) by a FRET reporter of histone tail environment. These measurements show that (i) mitotic compaction may start at least 20 min before prometaphase; (ii) it correlates with changes in histone tail conformation; (iii) chromatin density is not highest in metaphase but in late anaphase chromosomes. In the second part, I focused on the novel finding of highest compaction in anaphase. Single chromosome measurements revealed that chromatids compact in anaphase by a mechanism of lengthwise shortening that starts only after segregation of the sister chromatids is complete. This axial shortening was not affected in condensin-depleted cells, and was independent of the poleward pulling motion on kinetochores, but it nevertheless depended on dynamic microtubules. Perturbation of this shortening caused a severe phenotype of multi-lobulated daughter nuclei, strongly suggesting a function in post-mitotic nuclear assembly and architecture. In addition, if anaphase compaction was perturbed in condensin-depleted cells, segregation defects increased 3-fold, suggesting a second role for anaphase compaction as a rescue mechanism for segregation defects. In the third part, the quantitative compaction assays were used to probe the role of PNUTS, a major protein phosphatase 1 nuclear-targeting subunit, in the regulation of chromatin structure. In live cells depleted of PNUTS by RNAi, compaction was slowed at least 3-fold. Our collaborators in the group of Philippe Collas at the University of Oslo had shown that PNUTS accelerates chromatin decompaction in vitro. PNUTS is thus involved in mitotic chromatin structure in vivo and in vitro, and my findings make it an interesting target for future research to understand the molecular mechanism of chromosome compaction.

Translation of abstract (German)

Chromatin ist der physiologische Träger der genetischen und epigenetischen Erbinformation in Eukaryoten und liegt im Zellkern in Form von Chromosomen vor. Die Dynamik und Flexibilität der Chromatinstruktur ist essentiell für die Aktivitäten des Genoms. Die stärksten Veränderungen der Chromatinstruktur treten während der Mitose auf, wenn kompakte Metaphasechromosomen gebildet und gleichmässig auf zwei Tochterzellen verteilt werden. Die Mechanismen, die diesen Strukturänderungen zu Grunde liegen, sind in vivo bislang nur schlecht verstanden. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich daher eine Methode entwickelt, mit der man die Kinetik der Chromosomenkompaktierung während der Teilung lebender Zellen quantitativ bestimmen kann. Zellen, die das fluoreszenzmarkierte Histon 2b stabil exprimierten, wurden mittels mehrdimensionaler Konfokalmikroskopie untersucht. Die Kompaktierung der Chromosomen wurde auf drei verschieden Größenebenen bestimmt. Mit Hilfe von vierdimensionaler Konfokalmikroskopie wurde das Volumen des Chromatins mit einer Auflösung von ~800 nm gemessen. Durch die statistische Auswertung von Pixel-Intensitäten konnte eine Auflösung von ~200 nm erreicht werden. Zur Messung auf molekularer Ebene (~10 nm) wurde ein FRET-Reporter am Carboxyterminus des nucleosomalen Histons 2b eingesetzt. Die Messungen zeigten, dass (i) die mitotische Kompaktierung bereits mindestens 20 Minuten vor der Prometaphase beginnt, (ii) Kompaktierung mit molekularen Konformationsänderungen in der Carboxyterminalen Region des Histons korreliert, und (iii) die maximale Chromatindichte nicht in der Metaphase, sondern erst in der späten Anaphase erreicht wird. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich mich auf diese erstmals beschriebene maximale Kompaktierung während der Anaphase konzentriert. Messungen an einzelnen Chromosomen zeigten, dass die Kompaktierung in der Anaphase durch eine Verkürzung ihrer Längsachse hervorgerufen wird, welche erst nach der Trennung der Chromatiden einsetzt. Diese axiale Verkürzung verlief unverändert in Condensin-depletierten Zellen, und war unabhängig von der Kinetochor-vermittelten Bewegung der Chromatiden zum Spindlepol. Trotzdem war die axiale Verkürzung abhängig von der Gegenwart intakter dynamischer Mikrotubuli. Akute Störung der Verkürzung führte zu stark gelappten Zellkernen in den Tochterzellen. Dieser Phänotyp weist darauf hin, dass die zusätzliche Kompaktierung in der Anaphase für den korrekten Aufbau der Zellkernarchitektur nach der Mitose notwendig ist. Des Weiteren wurde durch akute Störung der Anaphasen-Kompaktierung in Condensin-depletierten Zellen die Zahl der Segregationsdefekte dreifach erhöht. Dies deutet auf eine weitere Funktion der Anaphase-Kompaktierung als Sicherungsmechanismus gegen Segregationsdefekte hin. Die entwickelte Methode zur Messung der Chromosomenkondensation wurde im dritten Teil meiner Dissertation verwendet, um die Funktion von PNUTS für die Regulation der Chromatinstruktur zu untersuchen. PNUTS ist eine regulative Untereinheit die Protein Phosphatase 1 in den Zellkern lokalisiert. In Zellen, in denen PNUTS durch RNAi depletiert worden war, war die Kompaktierung in Prophase dreimal langsamer als in Kontrollzellen. Unsere Kooperationspartner (Prof. Philippe Collas, Universität von Oslo) hatten zuvor in vitro zeigen können, dass Zugabe von PNUTS die Dekondensierung von Chromatin beschleunigt. Demzufolge ist PNUTS für die mitotische Chromatinstruktur sowohl in vitro als auch in vivo von Bedeutung und ein höchst interessantes Protein, um den unbekannten molekularen Mechanismus der Chromosomenkompaktierung im Detail zu untersuchen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jan Ellenberg, Dr.
Date of thesis defense: 16 June 2006
Date Deposited: 26 Oct 2006 14:32
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Chromosomenanalyse, Chromosomenkondensation, Quantitative Mikroskopie, Konfokale Mikroskopie, Laser-Rastermikroskopie, Mikroskopie, Mitose
Uncontrolled Keywords: Chromosomendynamik , Zellteilung , SäugerzellenQuantitative confocal microscopy , chromosome compaction , chromosome condensation , mitosis , live-cell imaging
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