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A NOVEL METHOD TO INTERFERE WITH GENE EXPRESSION IN MICE

Kirilov, Milen

German Title: Eine neue Methode Genexpression in Mäusen zu beinflussen

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Abstract

Transgenic animals are generated by injection of recombinant DNA sequences into fertilized oocytes. Here I applied a new methodology for the generation of transgenic knockdown mice using the LentiLox 3.7 lentivirus as a transfer vehicle bearing an U6-promoter dependent shRNA expression cassette. Lentiviruses are a sub-class of retroviruses that have the capability to infect non-dividing post-mitotic cells. Recently, in addition to their use to transform primary cells and established cell lines, lentiviruses have also been used to generate transgenic mice, pigs, cattle, rats and chickens. Thus, we hoped that lentiviral vectors containing U6/RNAi expression cassettes could serve as a fast and attractive alternative for the generation of mice with reduced expression of specific genes. As a model for this in vivo knockdown approach I chose the hepatocyte nuclear receptor 4gamma for which a knock out model was not available. Expression analyses of the HNF4gamma gene demonstrated synthesis of the protein in the embryonic gut at day E16.5. In adult animals its expression is restricted predominantly to the differentiated, absorptive brush border cells of the small intestine (enterocytes) and to the cells of pancreatic islets (islets of Langerhans). In order to knockdown the HNF4gamma gene, a panel of five shRNA hairpin sequences was selected by the public Sirna software and their activity was validated by transfection experiments in cell culture. After re-cloning of the U6/shRNA cassettes into the pLL 3.7 vector, infectious virus particles were generated and injected within the perivitelline space of one cell stage mouse embryos. 56% of the LentiLox 3.7 lentivirus founder mice were PCR-positive, however expression from the transgene was highly mosaic. The high mosaicism of F0 mice precluded their use for immediate expression analysis as it was hoped when the project was started. The high degree of mosaicism is also reflected by a low rate of germ line transmission. Only 6% of F1 mice expressed the indicator gene for EGFP as well as the shRNA transgene. Often expression was not ubiquitous probably reflecting the dependence of expression on the chromosomal integration site. A good correlation between EGFP activity and siRNA accumulation in organs of F1 mice was found as evidenced by Northern blot hybridisation. Despite the general low efficiency of transgenesis the down regulation of HNF4gamma gene in one F1 line (A-I) reached 50% in the gut and 80% in pancreas proving that this targeted knockdown approach is working in living animals.

Translation of abstract (German)

Transgene Mäuse werden durch Mikroinjektion von rekombinanter DNA in Oocyten erzeugt. In dieser Arbeit erzielte ich eine Geninaktivierung in transgenen Mäusen durch Verwendung des lentiviralen Expressionsvektors LentiLox 3.7, der eine durch den U6-Promotor kontrollierte Expressionskassette enthält. Lentiviren sind eine Unterklasse von Retroviren, die auch nicht in Zellteilung befindliche Zellen infizieren können. In letzter Zeit wurden lentivirale Vektoren, zusätzlich zu ihrer Verwendung in primären Zellen und permanenten Zellinien, auch zur Herstellung von transgenen Mäusen, Ratten, Schweinen, Rindern und Hühnern benutzt. Wir hofften, lentivirale Vektoren mit einer U6/RNAi-Expressionskassette könnten als attraktive schnelle Alternative für die Erzeugung von Mäusen mit einer reduzierten Expression spezifischer Gene verwendet werden unter der Vorstellung, dass die transgenen Mäuse dann ohne weiter Züchtung direkt analysiert werden könnten. Als Modell für dieses Vorgehen habe ich den hepatozytenspezifischen nukleären Faktor 4gamma gewählt, da für dieses Gen kein knock out-Modell existierte. Expressionsanalysen zeigten, dass das HNF4gamma-Protein im embryonalen Darm ab E 16.5 exprimiert wird. In adulten Tieren ist die Expression auf die differenzierten Bürstenepithelien (Enterozyten) des Dünndarms und auf Inselzellen im Pankreas (Langerhanssche Inseln) beschränkt. Zur Inaktivierung des HNF4gamma-Gens wurden fünf unterschiedliche shRNA-Sequenzen mit Hilfe der allgemein zugänglichen Sirna-Software ausgesucht und deren Aktivität durch Transfektion in Zellkultur getestet. Nach Umklonierung der U6/shRNA-Kassette in LentiLox 3.7 wurden infektiöse Partikel erzeugt und in den perivitellaren Raum von Mausembryonen (Einzell-Stadium) injiziert. In 56% der Mäuse aus den injizierten Embryonen (F0) konnte durch PCR ein positiver Nachweis für das virale Transgen geführt werden, die Expression des Transgens war aber sehr mosaik-artig. Der ausgeprägt mosaike Expression in F0-Mäusen verhinderte ihre Verwendung für eine direkte Analyse von HNF4gammaDefizienz, wie es zu Beginn des Projektes erhofft wurde. Der hohe Grad von mosaiker Expression spiegelte sich auch in der geringen Rate von Keimbahntransmission wieder. Nur 6% der F1-Mäuse exprimierte das Indikator-Gen EGFP sowie shRNA. Häufig war die Expression nicht ubiquitär, was vermutlich eine Abhängigkeit der Expression des Transgens von der chromosomalen Integrationsstelle anzeigt. Northern-Hybridisierung zeigte aber eine gute Korrelation zwischen der Intensität des EGFP-Signals und der Akkumulation der siRNA als Produkt der U6/shRNA-Expressionskassette. Trotz der allgemein niedrigen Effizienz der Transgenese war die Expression von HNF4-RNA in einer der F1-Linien (A-I) im Dünndarm um 50% und im Pankreas um 80% reduziert. Dies zeigt, dass die gewählte Methode zur Geninaktivierung prinzipiell auch in Tieren anwendbar ist, allerdings mit einer niedrigen Effizienz und ohne Zeitvorteil gegenüber der konventionellen knock out-Technologie.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schütz, Prof.Dr. Günther
Date of thesis defense: 7 July 2006
Date Deposited: 13 Jul 2006 11:46
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hausmaus, Genexpression, RNS-Interferenz
Uncontrolled Keywords: Transgene Maus , Lentivirus , HNF4gamma , mosaike Expression , LentiLox 3.7Transgenic mice , Lentivirus , knockdown , HNF4gamma , mosaicism
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