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Structural Characterisation of the Catalytic Core of the Class III Adenylyl Cyclase Rv0386 from Mycobacterium tuberculosis

Pancevac, Christina

English Title: Structural Characterisation of the Catalytic Core of the Class III Adenylyl Cyclase Rv0386 from Mycobacterium tuberculosis

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Abstract

Tuberkulose (TB) ist eine chronische Krankheit, an der ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert ist. Mehrfachresistente Mycobacterium tuberculosis-Stämme sind entstanden, die durch bisher existierende Antibiotika nicht bekämpft werden können. Wird die Krankheit nicht behandelt, könnte sie sich unkontrolliert ausbreiten und zur Pandemie anwachsen. Es ist daher dringend geboten, neue Methoden zur Bekämpfung von Tuberkulose zu finden. Das Interesse an mycobakteriellen Adenylat-Zyklasen (Adenylyl Cyclases, ACs), die den universellen second messenger cAMP herstellen, ist groß, insbesondere weil regulatorische Prozesse, an denen cAMP beteiligt ist, lebenswichtig für dieses Pathogen zu sein scheinen. Man findet erhöhte cAMP Konzentrationen während der Infektion in den Phagosomen, und dies scheint die Bakterien vor ihrer Vernichtung zu bewahren. Die große Zahl von ACn bei M. tuberculosis legt nahe, daß das Pathogen die Fähigkeit hat, extra- und intrazelluläre Signale wahrzunehmen und mittels cAMP darauf zu reagieren. Diese Vorgänge sind von fundamentalem Interesse, Studie der involvierten Enzyme könnte aber direkt zur Entwicklung von Medikamenten und damit zu neuen Behandlungsmethoden führen. In dieser Studie wird die kristallographische Röntgenstruktur der katalytischen Domäne (cyclase homology domain, CHD) der Klasse III-Adenylatzyklase Rv0386 aus Mycobacterium tuberculosis untersucht. Rv0386 ist eine außergewöhnliche Adenylatzyklase, da sie sowohl ATP als auch GTP als Substrat verwenden kann. Bisher wurden Klasse III-ACs als gegenläufige Dimere (head-to-tail) gefunden. Im Gegensatz dazu zeigt die Struktur von Rv0386 CHD einem neuen, Kopf-Kopf homodimeren Zustand, in dem sich keine aktiven Zentren ausbilden. Dies erklärt auch die geringe Aktivität des Proteins in vitro. Die Kontaktfläche des Dimers ist mit 1497 Å 2 recht groß. Um diesen neuen Dimer hinsichtlich der Kristallisation abzuklären, wurden die Eigenschaften in Lösung mittels Kleinwinkelröntgenstreuung untersucht. Dabei konnte der Kopf-Kopf Dimer verfiziert werden. Um die Substraterkennung zu studieren, wurde hier ein Modell des aktiven Zustands erstellt. Gezeigt werden die ATP- und GTP bindenden Aminosäuren Asn106 und Gln57, die beide Substrate erkennen können, wenn die Seitenketten jeweils um 180° gedreht werden. Eine Diskussion der homologen AC-Strukturen zeigt, dass im Gegensatz zum üblicherweise identifizierten achtsträngigen beta-Faltblatt der Klasse III-ACs bei Rv0386 CHD beta-Strang beta5 fehlt. Bei den gegenläufigen Dimeren trägt beta5 zum Interface bei, was vermuten läßt, daß beta5 in Rv0386 beim Übergang vom inhibierten zum aktiven Zustand gebildet wird. Da beta5 zusätzlich das katalytische Asn106 trägt, kann diese Region als Aktivitätsschalter während der Interaktion der Monomere im katalytischen Dimer angesehen werden. Um vom inaktiven Dimer zum katalytisch aktiven Dimer zu gelangen, müsste man eines der Monomeren um 48,2° drehen und 16,8 Å entlang der Rotationsachse verschieben. Kristallisation wurde mit zusätzliche Substraten oder Inhibitoren versucht. Allerdings scheint der Kopf-Kopf Dimer von Rv0386 CHD so stabil zu sein, dass der gegenläufige Dimer des aktiven Zustands nicht gebildet wird, sogar nach dem Versuch, die Substrat-Bindungsstellen zu besetzen. Co-Faktor Mangan ist notwendig für die Katalyse von Rv0386 CHD in vitro. Unerwarteterweise wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Mangan zusätzlich das Oligomerisierungsverhalten beeinflusst. In Gegenwart von Mn 2+ ist Rv0386 CHD ein Monomer, wie über Gel-Chromatographie, analytische Ultrazentrifugation und Kleinwinkelstreuung nachgewiesen. Versuche, den Monomer über Zugabe von Substrat-Analoga in den Dimer zu überführen, führte zu Kristallen, die jedoch für die Analyse noch weiter verbessert werden müssten.

Translation of abstract (English)

Tuberculosis (TB) is a chronic disease, with one third of the worlds’ population infected. Multi drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains have evolved, which are unaffected by the commonly used antibiotics. If the disease is not treated it could spread uncontrollably and become a pandemy. It is therefore imperative to identify novel drug targets. There is a great interest in adenylyl cyclases (ACs) from M. tuberculosis, which generate the universal second messenger cAMP, mostly since regulatory processes involving cAMP are vital for the pathogen. Elevated levels of cAMP are observed in phagosomes during infection, which protects the bacteria from elimination. The high number of ACs in M. tuberculosis suggests that the pathogen has the ability to sense and respond to a number of extracellular and intracellular signals through cAMP signalling. These processes are of fundamental interest, but investigation of the involved enzymes may also directly lead into the drug discovery process and result in new strategies for treatment. This study deals with the X-ray crystallographic structure determination of the catalytic core of cyclase homology domain (CHD) of the class III adenylyl cyclase Rv0386 from Mycobacterium tuberculosis. This CHD is exceptional as it can use both, ATP and GTP, as substrates. Class III CHDs have been shown to exist as dimers in a head-to-tail arrangement. In contrast, the structure presented here identifies a novel dimeric contact, which we define as head-to-head. In this state, the CHD cannot form proper active sites and thus is inhibited. This is in line with the low catalytic activity observed in vitro. The interface contact of the Rv0386 CHD dimer is substantial and buries 1497 Å 2. To test whether the contact was generated during crystallisation, the in-solution properties of Rv0386 CHD were examined by small angle X-ray scattering, which confirmed the head-to-head interface. To learn about the substrate recognition of the Rv0386 CHD, a model of the active state was created. It shows GTP/ATP binding by the non-canonical purine binding residues Asn106 and Gln57 made possible with 180° rotation of both amide side chains. A discussion of homologous AC structures reveals that in the commonly observed eight-stranded beta-sheet Rv0386 lacks the conserved beta-strand beta5. In the head-to-tail arrangement of a catalytically active dimer, beta5 contributes to the interface which suggests that beta5 forms in Rv0386 when in the active conformation. Since beta5 also carries catalytic residue Asn106, this region might be an activity switch operated on homo-dimerisation of the enzyme. To obtain the active conformation, one of the two CHDs of Rv0386 as observed in the crystal structure would have to rotate around 48.2° and translated by 16.8 Å. Crystallisation trials to obtain the active state were carried out in the presence of substrates or inhibitors. However, the dimer contact of Rv0386 CHD to form the head-to-head dimer is clearly more stable than the head-to-tail dimer in the active state, even when attempting to occupy the substrate binding pockets. The cofactor manganese is required for Rv0386 CHD catalytic activity in vitro. In this work manganese additionally was identified to interfere with dimerisation of Rv0386 CHD, which was unexpected. In the presence of Mn 2+, Rv0386 CHD is monomeric as characterised by size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation and small angle X-ray scattering. Attempts were made to convert the monomeric species to a catalytic dimer by addition of substrate analogs. Initial crystals obtained would require further improvement.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Irmgard Sinning, Prof.
Date of thesis defense: 26 July 2006
Date Deposited: 27 Jul 2006 15:05
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Adenylat-Zyklase , cAMP , Mycobacterium tuberculosis , Tuberkulose , Kristallographie , Rv0386Adenylyl cyclase , cAMP , Mycobacterium tuberculosis , X-ray crystallography , Rv0386
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