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Charakterisierung des molekularen Mechanismus der Stabilisierung des Peptidtransporters TAP durch das ER-Glykoprotein Tapasin

Papadopoulos, Martina

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PDF, German
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Abstract

Haupthistokompatibilitäts-(MHC)Klasse-I-Moleküle präsentieren den CD8+-T-Lymphozyten intrazellulär prozessierte Antigene. Die Präsentation ist durch eine Vielzahl an Hilfsproteinen einschließlich Tapasin (Tpn) und dem Transporter associated with Antigen Processing (TAP), der aus den nicht kovalent verknüpften TAP1- und TAP2-Untereinheiten besteht, reguliert. Das ER-residente Glykoprotein Tpn hat eine duale Chaperonfunktion, indem es die Peptidfracht der MHC-Klasse-I-Moleküle innerhalb des TAP-assoziierten Peptidbeladungskomplex optimiert und unabhängig davon das Expressionsniveau von TAP reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität der TAP-Untereinheiten in Anwesenheit und Abwesenheit von Tpn untersucht. Dazu wurden TAP1- und TAP2-Untereinheiten voller Länge und N-terminal verkürzte TAP1- und TAP2-Untereinheiten, die jeweils C-terminal mit EGFP markiert waren, entweder in TAP1/2-defizienten und Tpn-/--MC4-Zellen oder in Tpn-kompetenten MCB6TAP1-/--Zellen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass die N-Domäne von TAP2 für die Tpn-vermittelte Stabilisierung des TAP1/TAP2-Heterodimers wichtig ist. TAP1 war in Abwesenheit von Tpn dagegen stabil. Die TAP2-Untereinheit war daher das geeignete Indikatormolekül, um den kaum verstandenen molekularen Mechanismus der Tpn-vermittelte TAP-Stabilisierung in Tpn-transfizierten MC4-Zellen detailliert zu untersuchen. Hierfür wurden einerseits in der Transmembrandomäne (TMD) und/oder im N-terminal angrenzenden Verbindungspeptid (CP) von Maus(m)-Tpn einzelne oder multiple konservierte Aminosäuren ausgetauscht und andererseits mTpn-TMD-Chimären hergestellt in denen die TMD von mTpn durch heterologe TMD ausgetauscht wurden. Zunächst stellte sich heraus, dass ausgewählte einzelne konservierte Aminosäuren in der TMD von mTpn keine signifikante Rolle bei der TAP-Stabilisierung spielen. Nur die Substitution eines hochkonservierten sauren Motivs (E414/D415) im CP reduzierte die TAP2-Stabilisierung drastisch. Allerdings funktionierte das saure Motiv nicht unabhängig von der Tpn-TMD. Durch weitere Mutationsanalysen konnte zum ersten Mal eine einzelne Aminosäure im CP identifiziert werden, die an der TAP-Stabilisierung beteiligt ist und zwar Glu in der Position 414. Die Ergebnisse des Austausches multipler Aminosäuren innerhalb der TMD zeigte, dass die TAP-Stabilisierungsfunktion von Tpn nicht durch einzelne, sondern durch ein räumliches Motiv an einer Flanke der membranquerenden Helix von Tpn bestehend aus den konservierten Aminosäuren F420, F424, G428, K431 und W435 ausgeübt wird. Der kombinierte Austausch von E414 im CP und des räumlichen Motivs erbrachte einen kompleten Verlust der Tpn-vermittelten TAP2-Stabilisierung und zeigte damit eine kooperative Wirkung dieser funktionsbestimmenden Aminosäuren auf. Die konservierten Aminosäuren des räumlichen Motivs befinden sich hauptsächlich im N-terminalen Teil der TMD von Tpn und interagieren vermutlich mit einer oder mehreren Transmembranhelices innerhalb der N-Domänen von TAP. Dagegen interagiert die ER-luminal exponierte Aminosäure E414 möglicherweise mit einer basischen Aminosäure in einer ER-exponierten Schleife innerhalb der N-Domänen von TAP. Die beschriebenen konservierten Aminosäuren scheinen zwar notwendig, aber nicht ausreichend für die Tpn-Funktion zu sein, da sie sich nicht in die TMD von Calnexin transplantieren ließen. Der Sequenzkontext innerhalb der TMD von Tpn liefert vermutlich zusätzliche essentielle Informationen. In Anwesenheit von verschiedenen Tpn-Mutanten konnte gezeigt werden, dass bereits deutlich reduzierte TAP2-Mengen ausreichen, um die peptidtransportabhängige MHC-Klasse-I-Expression zu induzieren. Die MHC-Klasse-I-Induktion war in guter Korrelation mit der TAP2-Stabilisierung. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die konservierten Aminosäuren F420, F424, G428, K431 und W435, die ein räumliches Motiv innerhalb der TMD bilden, und die saure Aminosäure E414 im CP für die Tpn-vermittelte Stabilisierung von TAP2 notwendig sind. Für die TAP1-Stabilisierung scheint Tpn keine entscheidende Rolle zu spielen.

Translation of abstract (English)

Presentation of intracellular processed antigens by major histocompatibility (MHC) class I molecules to CD8+ cytotoxic T lymphocytes is regulated by a variety of accessory proteins including Tapasin (Tpn) and the Transporter associated with antigen processing (TAP) composed of the non-covalently linked subunits TAP1 and TAP2. The ER-resident glycoprotein Tpn has a dual chaperone function as it optimizes the peptide cargo of class I molecules within the TAP-associated loading complex and independently stabilizes the steady state expression level of TAP. In the present thesis the stability of the TAP subunits in the presence or absence of Tpn was analyzed. Full length and N-terminally truncated TAP1 and TAP2 EGFP-tagged subunits were expressed either in TAP1/2- and Tpn-deficient MC4 cells or in Tpn-competent MCB6TAP1-/- cells. It could be shown that the N-domain of TAP2 is essential for the Tpn-mediated stabilization of the TAP1/TAP2 heterodimer while TAP1 is stable in the absence of Tpn. Therefore, the TAP2 subunit was utilized to explore in detail the poorly understood molecular mechanism of the Tpn-mediated TAP stabilization in Tpn-transfected MC4 cells. For this purpose single or multiple conserved amino acids in the transmembrane domain (TMD) and/or in the connecting peptide (CP) of mouse (m) Tpn, which locates adjacent to the Tpn TMD, were substituted on the one hand and mTpn TMD chimeras were generated in which the entire mTpn TMD was replaced by heterologous TMDs on the other hand. Initially it turned out that selected single conserved amino acids within the TMD of mTpn are not critical for the TAP stabilization. Only the substitution of the conserved acidic motif E414/D415 in the CP reduced the TAP2 stabilization dramatically. However, the acidic motif did not function independently of the Tpn TMD. Our mutational studies identified for the first time the single amino acid E414 in the CP as being crucial for the TAP stabilization. The results of exchanges from multiple amino acids within the TMD revealed that the TAP-stabilizing function of Tpn is exerted by a spatially arranged motif composed of the conserved amino acids F420, F424, G428, K431 and W435 which seem to function cooperatively with the amino acid E414 in the CP in order to stabilize the TAP2 protein. The conserved amino acids of the spatial motif reside mainly in the N-terminal portion of the TMD. These amino acids may interact with one or multiple transmembrane helices within the hydrophobic N-domains of TAP. In contrast, the ER-luminal exposed amino acid E414 may interact with a basic residue in an ER-exposed loop of the N-domains of TAP. However, the conserved amino acids appear to be necessary but not sufficient for Tpn function as we were unable to transfer the motif onto the unrelated TMD of calnexin. The sequence context of the TMD of Tpn presumably contributes essential additional information. It was shown that in the presence of different mTpn mutants clearly reduced amounts of TAP2 were sufficient to induce the peptide transport-dependent induction of MHC class I molecules. Class I induction was in good correlation with TAP2 stabilization. In this thesis it is shown for the first time that the conserved amino acids F420, F424, G428, K431 and W435 which form a spatially arranged motif within the TMD and the acidic amino acid E414 in the CP is essential for the Tpn-mediated stabilization of TAP2. Tpn does not seem to play a crucial role for TAP1 stabilization.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hämmerling, Prof. Dr. Günter J
Date of thesis defense: 26 July 2006
Date Deposited: 02 Aug 2006 07:32
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: MHC Klasse I, Peptidtransporter
Uncontrolled Keywords: Tapasin , TAP
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