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Chlorid-basierte Signalverstärkung in Capsaicin-sensitiven Schmerzzellen

Gilbert, Daniel

English Title: Chloride based signal amplification in capsaicin sensitive pain cells

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PDF, German
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Abstract

Polymodale Schmerzzellen exprimieren Transduktionskanäle, die durch gewebe-schädigende Reize aktiviert werden und einen depolarisierenden Ca2+-Fluß in die Zelle leiten. Einige Schmerzzellen exprimieren Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle, die durch den Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration geöffnet werden und einen auswärtsgerichteten Cl--Fluß leiten. Dieser Cl--Efflux depolarisiert die Zellen zusätzlich und bewirkt eine Ver-stärkung der sensorischen Signale. Der „Gain“ dieses Cl--basierten Verstärkungs-mechanismus wird durch die intrazelluläre Cl--Konzentration ([Cl-]i) bestimmt. Es ist be-kannt, dass Cl--Akkumulation in Schmerzzellen durch den Na+/K+/2Cl--Transporter NKCC1 vermittelt wird. Zur [Cl-]i von Schmerzzellen gibt es dagegen keine zuverlässigen Informationen. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob und welche Schmerzzellen den Cl--basierten Verstärkungsmechanismus nutzen. In dieser Arbeit wurde durch Zwei-Photonen Fluoreszenz-Lebenszeit-Imaging-Mikroskopie (2P-FLIM) mit Schmerzzellen in Gewebepräparationen von Mäusen gezeigt, dass die [Cl-]i während der postnatalen Entwicklung verändert wird. In Schmerzzellen neu-geborener Tiere ist die [Cl-]i homogen und hoch, wogegen sie in adulten Tiere über einen großen Konzentrationsbereich streut. Diese Ergebnisse konnten in vitro, an kultivierten Schmerzzellen einer adulten Ratte, mit 2P-FLIM bestätigt werden. Durch funktionelles in vitro-Cl--Imaging mit Schmerzzellen adulter Mäuse, und in Patch-Clamp-Experimenten mit kultivierten Schmerzzellen adulter Ratten wurden Hin-weise erarbeitet, dass TRPV1-exprimierende, Capsaicin-sensitive Schmerzzellen den Cl--basierten Mechanismus zur Verstärkung sensorischer Signale verwenden. In Ganzzell-Ab-leitungen wurden Capsaicin-induzierte, exzitatorische Cl--Ströme mit stark variierenden Amplituden gemessen, die die variierenden [Cl-]i von Schmerzzellen adulter Tiere widerspiegeln. Für kinetische Untersuchungen von TRPV1-Kanälen haben wir Na-CDMNB-caged Capsaicin entwickelt. Seine Verwendbarkeit wurde in dieser Arbeit nachgewiesen. Es wurde eine Adenovirus-basierte Methode etabliert, um kultivierte Schmerzzellen mit dem Anionen-sensitiven YFPI152L auszustatten. Zudem wurde eine Zellerkennungs-Software entwickelt, die automatisiertes in vitro-Cl--Imaging ermöglicht. Es kann nun nach spezifischen Agonisten oder Antagonisten für Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle gesucht werden und es ist möglich, weitere sensorische Modalitäten zu identifizieren, die den Verstärkungssmechanismus nutzen.

Translation of abstract (English)

Polymodal pain cells express transduction channels, which conduct cations into the cell upon activation and cause an increase of the intracellular calcium concentration. This leads to a depolarisation of the plasma membrane and the activation of Ca2+-activated Cl- channels. These channels conduct an outward-directed and excitatory Cl--current which causes an additional depolarisation of the cell and the amplification of the receptor current. The gain of this chloride based amplification mechanism depends on the intracellular chloride concentration. It has been shown, that Cl--accumulation in pain cells is performed by the Na+/K+/Cl--cotransporter NKCC1, but there is no reliable information avaliable about the intracellular Cl--concentration in pain cells. Furthermore it is not known, which and whether pain cells employ the Cl--based amplification mechanism. Two-photon fluorescence-lifetime-imaging-microscopy (2P-FLIM) with pain cells in tissue preparations (dorsal root ganglia) of mouse revealed that the intracellular Cl--concentration ([Cl-]i) of pain cells changes during postnatal development. The [Cl-]i of pain cells from newborn mice is homogenous and high and is distributed heterogeneously in adult animals. These results were confirmed in vitro, with primary cultured pain cells of adult rats. Functional Cl--imaging and patch-clamp experiments with cultured pain cells of adult rats provided evidence, that capsaicin sensitive pain cells, which express TRPV1 channels, employ the Cl--based mechanism. In accordance to the heterogeneous distribution of [Cl-]i of pain cells in adults animals, the application of capsaicin induced outward-directed Cl--currents of varying amplitude in whole cell recordings with cultured pain cells of rat. For kinetic experiments with TRPV1 channels in pain cells we developed Na-CDMNB-caged capsaicin. Its suitability for kinetic investigations was confirmed in this thesis. The infrastucture for future Cl--imaging experiments with cultures pain cells was created: An adenovirus based method of genetic manipulation, to equip cultured pain cells with the anion-sensitive YFPI152L, as well as a software for stucture recognition in fluorescence images, which can be used for selective intensity analysis of pain cells in co-cultures. Both are tools which permit automated high throughput screenings to search for specific agonists or antagonists which affect the function of Ca2+-activated Cl- channels and simplify the investigation of their physiological properties.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Frings, Prof. Dr. Stephan
Date of thesis defense: 20. July 2006
Date Deposited: 02. Aug 2006 07:30
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Schmerz , Spinalganglien-Neurone , Capsaicin , TRPV1 , Chloridhaushalt , Kalzium-aktivierte Chlorid-Kanäle , 2P-FLIM , Elektrophysiologie
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