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In vitro Selektion von Ribozymen für eine Aldolreaktion – Isolierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren mit katalytischen Eigenschaften

Weigand, Barbara-Sylvia

English Title: In vitro selection of ribozymes for an aldol reaction- isolation and characterisation of nucleic acids with catalysing features

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PDF, German
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Abstract

Durch die in vitro Selektion konnte im Laufe der letzten 20 Jahre eine Reihe an künstlichen RNA-Enzymen (Ribozyme) entwickelt werden. Die Fähigkeit der Ribozyme, eine große Bandbreite an organischen Reaktionen zu katalysieren, unterstützt die Hypothese der RNA-Welt, der zufolge in einer früheren Welt metabolische Umwandlungen durch RNA-Moleküle bewerkstelligt wurden. Die Bindungsausbildung zwischen zwei Kohlenstoffatomen dürfte in solch einer Welt auch bereits eine erhebliche Rolle gespielt haben. In der Natur werden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen überwiegend durch Aldolreaktionen gebildet, wobei Aldolasen die Reaktion in einem Enaminmechanismus (Klasse I) oder mit Hilfe von Zinkionen (Klasse II) katalysieren. Diese Arbeit beschreibt die Etablierung einer Selektionsstrategie zur Generierung von Ribozymen, die eine Aldolreaktion ähnlich den Aldolasen katalysieren sollen. Für die direkte in vitro Selektion mit photospaltbaren linkerkoppelten Reaktanden wurden zwei verschieden lange RNA-Bibliotheken verwendet. Die Einführung des Aldoldonors an den 3’-Terminus der kombinatorischen Bibliotheken erfolgte über einen flexiblen Dinukleotidlinker durch enzymatische Ligation. Nach stattgefundener Reaktion mit dem biotinylierten Aldolakzeptor konnten aktive RNA-Moleküle durch Affinitätschromatographie von nicht-umgesetzten Sequenzen abgetrennt und durch die im Linker enthaltene photospaltbare o-Nitrophenyleinheit selektiv freigesetzt werden. Die Photospaltstelle im Linker sollte hierbei die Regioselektivität der Aldolreaktion und eine ungewollte Anreicherung an Spezies, die Nebenreaktionen bevorzugen, gewährleisten. In dem kürzeren Pool, der einen randomisierten Bereich von 70 Nukleotiden aufwies, wurde eine Anreicherung an Spezies beobachtet und nach 13 bzw. 14 Runden kloniert und sequenziert. Es wurden insgesamt 85 Sequenzen isoliert, die in 12 Familien mit insgesamt 34 Mitgliedern eingeteilt werden konnten. Sekundärstrukturanalyse und -vergleiche wurden durchgeführt. Zur kinetischen Charakterisierung der isolierten Sequenzen wurden verschiedene Ansätze ausgetestet. Die genauer charakterisierten Spezies beschleunigen die Reaktion zwischen dem 230- und 500-fachen und weisen eine scheinbare Geschwindigkeitskonstante zwischen 2.4 ∙ 10-5 und 5.3 ∙ 10-5 M-1s-1auf. Durch die erfolgreiche Selektion von Sequenzen, die eine Aldolreaktion beschleunigen, konnte das Reaktionsspektrum, das durch RNA katalysiert wird, ausgebaut und die Hypothese der präbiotischen RNA-Welt weiter untermauert werden.

Translation of abstract (English)

During the past 20 years several artifical RNA-enzymes (ribozymes) have been developed by in vitro selection. The ability of ribozymes to catalyse a broad spectrum of organic reactions supports the hypothesis of the RNA world in which metabolic transformations were carried out by RNA molecules. The bond formation between two carbon atoms could have played a role in the RNA world as well. In nature carbon-carbon bonds are mainly formed by the aldol reaction catalysed by aldolases either via an enamine mechanism (class I) or by zinc iones (class II). This work describes the establishment of a selection strategy for generation of ribozymes which should catalyse the aldol reaction in a manner similar to aldolases. Two RNA libraries with different lengths were subjected to the direct in vitro selection with photo-cleavable linker-coupled reactant. The aldol donor was attached via a flexible dinucleotide linker to the 3’-terminus of the combinatorial library by using enzymatic ligation. By reaction with the biotinylated aldol acceptor active RNA molecules could be separated from unreacted sequences by affinity chromatography and were selectively released by cleaving the photo-sensible o-nitrophenyl moiety contained in the linker. The photo-cleavage step should control the regioselectivity of the aldol reaction and prevent the undesired enrichment of species which favour side reactions. An enrichment of active species were obtained in the shorter pool with 70 randomised nucleotides and after 13 and 14 rounds the enriched pools were cloned and sequenced. In total 85 sequences were obtained, 31 of which could be classified into 12 families. In addition the analysis and comparison of the secondary structures were achieved. For kinetic characterisation of the isolated sequences different approaches were tested. Two species characterised in more details accelerate the reaction about 230- and 500-fold, respectively, and the apparent rate constants are 2.4 ∙ 10-5 and 5.3 ∙ 10-5 M-1s-1, respectively. By this successful selection the spectrum of reactions catalysed by RNA could be expanded and it supports the hypothesis of a prebiotic RNA world.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Andres
Date of thesis defense: 13. July 2006
Date Deposited: 03. Aug 2006 15:01
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: RNS, Ribozym, Aldolreaktion, Katalyse
Uncontrolled Keywords: SELEXRNA , ribozyme , aldol reaction , catalysis
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