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Characterisation of protein phosphorylation in Arabidopsis thaliana and Chlamydomonas reinhardtii based on affinity chromatography and mass spectrometry

Wolschin, Florian

German Title: Charakterisierung der Proteinphosphorylierung in Arabidopsis thaliana und Chlamydomonas reinhardtii basierend auf Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie

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Abstract

Reversible protein phosphorylation is of key importance for several mechanisms of life. However, the low abundance of phosphorylated proteins hinders investigations following this direction. To circumvent this problem a new method for the enrichment of phosphorylated proteins out of complex protein mixtures was developed. This method relies on the affinity of the phosphate group towards aluminum hydroxide and was termed MOAC (Metal Oxide Affinity Chromatography). Successful phosphoprotein enrichment even from highly complex protein mixtures was confirmed by separation of phosphorylated from non-phosphorylated standard proteins, detection using a phosphate-specific fluorescent stain, ICP-MS (Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry), and antibodies. To identify phosphopeptides and protein phosphorylation sites proteins were digested with an endoproteinase and subjected to LC/MSn analysis. The determination of protein phosphorylation sites was achieved by making use of the distinct neutral loss of phosphoric acid from peptides phosphorylated on serine or threonine during fragmentation in an ion trap mass spectrometer. However, it was observed that also other posttranslational modifications such as methionine oxidation can mimic phosphorylation when using such data-dependent neutral loss scans. Remedies were defined to circumvent this problem leading to more reliable phosphorylation site identification. The combination of MOAC and a neutral loss driven MS3 approach showed to be highly useful for investigations on plant protein phosphorylation. In one of the first non-targeted phosphoproteomics approaches in plant science this combined approach was applied to enrich phosphoproteins of A. thaliana and of C. reinhardtii leading to the identification of over 40 phosphopeptides, 27 phosphorylation sites, and over 30 phosphoproteins. In addition, over 300 putative phosphoproteins were identified. In a targeted analysis the speculative in vivo phosphorylation site of the metabolic key enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase in A. thaliana could be confirmed. While the detection of phosphorylation and the determination of phosphorylation sites are very important to get a first impression whether or not a protein can be influenced by phosphorylation, quantification of phosphorylation delivers more detailed information on protein regulation by phosphorylation. Using an approach involving ICP-MS it was possible to monitor the overall protein phosphorylation degree for different developmental stages of A. thaliana. These values were compared to the degree of phosphorylation of proteins in C. reinhardtii. This comparison shows that protein phosphorylation is most abundant in rapidly dividing tissue and lowest in dormant seeds. To monitor phosphorylation of key metabolic enzymes under different physiological conditions, a robust method for relative quantification of changes in protein phosphorylation on a linear ion trap was also developed. It was used to investigate a speculative connection between temperature and phosphorylation of sucrose-phosphate synthase (SPS) and to determine the stoichiometry of phosphorylation for the in vitro phosphorylated enzyme. The results indicate that temperature has a profound effect on the phosphorylation level of SPS by influencing the activity or abundance of the kinase responsible for SPS phosphorylation.

Translation of abstract (German)

Reversible Proteinphosphorylierung ist für viele Mechanismen des Lebens von zentraler Bedeutung. Die geringe Abundanz von Phosphoproteinen erschwert jedoch deren Analyse. Um dieses Problem zu umgehen wurde eine neue Methode für die Anreicherung von Phosphoproteinen aus komplexen Proteinmischungen entwickelt. Sie basiert auf der Affinität der Phosphatgruppe zu Aluminiumhydroxid und wurde MOAC genannt (Metal Oxide Affinity Chromatography). Die erfolgreiche Anreicherung von Phosphoproteinen aus hochkomplexen Proteinmischungen wurde durch die Trennung von phosphorylierten und nichtphosphorylierten Standardproteinen, die Detektion mittels eines phosphatspezifischen Fluoreszenzfarbstoffes, ICP-MS (Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry) und die Verwendung von Antikörpern bestätigt. Um Phosphopeptide und Proteinphosphorylierungsstellen zu identifizieren, wurden Proteine mit einer Endoproteinase verdaut und per LC/MSn analysiert. Die Bestimmung von Proteinphosphorylierungsstellen wurde durch die Verwendung des charakteristischen Neutralverlustes von Phosphorsäure, wie er während der Fragmentierung in einer Ionenfalle bei Peptiden die an Serin- oder Threoninresten phosphoryliert sind, erreicht. Es wurde allerdings beobachtet, dass andere posttranslationale Modifikationen wie Methioninoxidation eine Phosphorylierung während solcher Analysen imitieren können. Daher wurden Kriterien definiert um bei diesem Problem Abhilfe zu schaffen und zu einer verlässlicheren Bestimmung von Phosphorylierungsstellen zu gelangen. Die Kombination von MOAC und des Neutralverlust-abhängigen Ansatzes erwies sich als sehr nützlich für die Untersuchung der Proteinphosphorylierung bei Pflanzen. In einer der ersten ungerichteten Analysen im Berich Pflanzenproteomics wurde dieser kombinierte Ansatz verwendet um Phosphoproteine von A. thaliana und C. reinhardtii anzureichern und über 40 Phosphopeptide, 27 Phosphorylierungsstellen und über 30 Phosphoproteinen zu identifizieren. Zusätzlich wurden über 300 putative Phosphoproteine identifiziert. In einer zielgerichteten Analyse wurde die spekulative in vivo Phosphorylierungsstelle des metabolischen Schlüsselenzyms Phosphoenolpyruvatcarboxylase in A. thaliana bestätigt. Während die Detektion der Phosphorylierung und die Bestimmung von Phosphorylierungsstellen sehr wichtig ist um einen ersten Eindruck davon zu erlangen, ob ein Protein durch Phosphorylierung beeinflusst werden kann, liefert die Quantifizierung der Phosphorylierung detailliertere Informationen über Proteinregulation durch Phosphorylierung. Unter Verwendung der ICP-MS war es möglich den Phosphorylierungsgrad des gesamten Proteoms für verschiedene Entwicklungsstadien von A. thaliana zu ermitteln. Diese Werte wurden mit dem Phosphorylierungsgrad von C. reinhardtii verglichen. Die Daten zeigen, dass Proteinphosphorylierung am häufigsten in sich schnell teilendem Gewebe und am wenigsten häufig in ruhenden Samen vorkommt. Um die Phosphorylierung von metabolischen Schlüsselenzymen unter unterschiedlichen physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurde eine robuste Methode auf einer linearen Ionenfalle entwickelt, die der relativen Quantifizierung von Änderungen in der Proteinphosphorylierung, inklusive der Phosphorylierungsstöchiometrie dient. Diese Methode wurde verwendet um einen spekulativen Zusammenhang zwischen der Temperatur und der Phosphorylierung der Sucrose-phosphatsynthase (SPS) in vitro zu untersuchen. Die Resultate deuten darauf hin, dass die Temperatur einen ausgeprägten Effekt auf die SPS Kinase und damit die Phosphorylierung der SPS hat.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wink, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 11 August 2006
Date Deposited: 17 Aug 2006 11:24
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteomanalyse, Phosphorylierung, ICP-Massenspektrometrie, Massenspektrometrie, LC-MS, Ackerschmalwand, Affinitätschromatographie
Uncontrolled Keywords: Chlamydomonas reinhardtii , Arabidopsis thaliana , Proteinphosphorylierung , AluminiumhydroxidProteomics , Mass Spectrometry , Protein phosphorylation , Affinity Chromatography , Aluminum hydroxide
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