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Microarray-basierte genotypische Resistenzbestimmung in HIV

Schanné, Michaela

English Title: Microarray-based genotypic resistance testing in HIV

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PDF, German
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Abstract

Eines der Hauptprobleme der antiviralen Therapie ist das Entstehen resistenzassoziierter Mutationen. Der Nachweis solcher Mutationen ist für eine erfolgreiche Therapie eine entscheidende Voraussetzung. In dieser Arbeit wurde ein Microarray zur Detektion von relevanten Mutationen innerhalb der Protease (PR) und –Reversen Transkriptase (RT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) entwickelt und validiert. Als zeit und kostengünstigere Alternative zur routinemäßig eingesetzten Sanger-Sequenzierung wurde die Arrayed Primer Extension (APEX)-Methode zur genotypischen Resistenzbestimmung etabliert. Zur Abfrage von 26 resistenzassoziierten Codons innerhalb der PR- und 33 Codons innerhalb der RT-kodierenden Region wurden Oligonukleotide erstellt. Aufgrund der enormen Variabilität des HIV Genoms berücksichtigen diese alle Sequenzvarianten, die mit einer Frequenz von >5% (PR) bzw. >10% (RT) in der Los Alamos Datenbank verzeichnet sind. Um diese Sequenzabdeckung technisch und finanziell zu realisieren, wurde die Verwendung degenerierter Oligonukleotidsonden für APEX etabliert. Für die Validierung des PR und RT Microarrays wurden 94 bzw. 48 PCR Produkte aus Patientenproben mit bekannter Sequenz analysiert. Dafür wurden die APEX-Reaktionsbedingungen erfolgreich angepasst. Die Vergleichssequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung ermittelt. 93% (PR) bzw. 88% (RT) aller untersuchten Positionen wurden mittels APEX übereinstimmend bestimmt. Der Anteil an Positionen, für die aufgrund schwacher Signalintensitäten keine Sequenzzuweisung vorgenommen werden konnten, liegt bei 3% (PR) und 5% (RT). Es wurde gezeigt, dass dieses Ergebnis durch Optimierung der Sonden deutlich verbessert wird. Die zufällig ausgewählten Proben umfassten sowohl HIV-Subtyp B als auch nicht Subtyp B Sequenzen. Aufgrund der verwendeten Sonden ist die Übereinstimmung für die untersuchten Subtyp B Proben im Vergleich mit den nicht Subtyp B Proben höher (94% / 88% für PR; 88% / 84% für RT). Sequenzmischungen wurden qualitativ gut detektiert, eine Quantifizierung ist aber Sonden-abhängig. Der Fehlerbereich ist vergleichbar mit dem anderer Genotypisierungsmethoden. Das entwickelte Testverfahren kann kostengünstig mit hohem Probendurchsatz durchgeführt werden. Parallel zur HIV-Genotypisierung wurde anhand zweier Beispiele gezeigt, dass auch Mutationen im Wirtsgenom, die mit der Krankheitsprogression assoziiert sind, sehr gut mittels APEX nachgewiesen werden können. Dies wird künftig eine sinnvolle Ergänzung des Microarrays sein und eine individuellere Therapie ermöglichen.

Translation of abstract (English)

Mutations that confer drug resistance are a major obstacle in antiviral therapy. The detection of such mutations in the protease (PR) and reverse transcriptase (RT) of human immunodeficiency virus (HIV) is an important step in the successful treatment of HIV indection. A standard method involved in mutation detection, Sanger sequencing, has proven to be costly and temporally disadvantegous. In order to overcome such inadequacies, a genotypic resistance assay based on APEX has been developed and established. Oligonuceotides were designed for the detection of 26 resistance related codons in PR and 33 codons in RT coding region. Due to the immense sequence heterogeneity of the viral genome, primers were selected to map sequence variants that representing >5% PR and >10% RT in the Los Alamos Sequence Databank. The application of degenerated primers to APEX was successfully established to cover all these sequence combinations. For microarray validation 94 PR and 48 RT patient derived PCR products were analysed. As reference sequences, information of these samples were previously obtained by Sanger sequencing. Concordance between the reference method and APEX was high, at 93% and 88% for PR and RT, respectively. Due to weak signal intensities it was impossible to determine the sequence via primer extension for 3% PR and 5% RT of positions analyzed. Efficiency of detection was improved by modification of the chip layout by optimization of oligonucleotides, demonstrated by means of the protease microarray. The analyzed patient set was randomly chosen und contained HIV-subtype B as well as non-subtype B samples. Currently, non-subtype B samples could be investigated by PR and RT microarrays. Concordance with standard sequencing is lower than for subtype B sequences (88%/94% for PR; 84%/88% for RT). Furthermore the microarrays provided a confident detection of sequence mixtures in a qualitative manner; however quantification is dependent on site-specific oligonucleotides. The developed APEX assay achieves similar results compared with other methods for genotypic resistance testing in HIV. The developed microarrays allow a cost- and time-effective genotypic resistance testing in a high-throughput manner. In addition to HIV resistance testing it is useful to acquire information about several host genes which are involved in the progression to AIDS. For two examples it was shown that relevant mutations can be very well detected by APEX. The parallel analysis of such mutations will enable a more individualized therapy.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kräusslich, Prof. Hans-Georg
Date of thesis defense: 21 July 2006
Date Deposited: 25 Sep 2006 14:58
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: HIV, Microarray, Resistenzbestimmung
Uncontrolled Keywords: GenotypisierungHIV , microarray , resistance testing
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