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Development and application of a high throughput cell based assay to identify apoptosis inducing proteins, and functional characterization of the candidate Vacuole Membrane Protein 1 (Vmp1)

Sauermann, Mamatha

German Title: Entwicklung und Anwendung eines zellbasierten Hochdurchsatz-Assays zur Identifizierung Apoptose-induzierender Proteine und anschließende funktionellen Charakterisierung des Proteins Vacuole Membrane Protein 1 (Vmp1)

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Abstract

The aim of the project was to identify and functionally characterize novel human proteins that dominantly induce apoptosis upon overexpression. To achieve this, a cell-based high throughput assay was developed. The assay is based on the detection of activated caspase-3 in cells overexpressing proteins tagged C- and N-terminally with YFP. Apoptotic cells were detected by staining with a specific antibody directed against the activated form of caspase-3. The assay was automated and data acquisition was done using a flow cytometer with an integrated 96-well plate reader. A total of 200 proteins have been screened in the assay, out of which five were identified to be significant activators of apoptosis. One of the candidates, Vacuole Membrane Protein 1 (Vmp1), which forms vacuoles in cells and subsequently induces apoptosis when overexpressed, has been functionally characterized in detail. It has been reported that VMP1 mRNA is differentially expressed in cancer, acute pancreatitis and kidney ischemia and that the overexpressed protein is localized to the Endoplasmic reticulum. But the function of this protein and its role in cancer and other diseases was previously unknown. In this study I show that the vacuoles are formed by the Endoplasmic reticulum due to accumulation of overexpressed Vmp1, and that Vmp1 is actually a plasma membrane protein involved in the formation of initial cell-cell contacts. Its function as a cell-cell adhesion protein was confirmed by identifying that Vmp1 interacts with the tight junction protein ZO-1, and that down regulation of Vmp1 induces cell detachment. Further, down regulation of Vmp1 resulted in a massive increase in the invasion potential of kidney cancer cells, which is consistent with the findings that VMP1 mRNA level is significantly lower in kidney metastases compared to primary tumours. Thus, these results are the first to show that Vmp1 is a cell adhesion protein, and that its expression level is a critical determinant of cancer cell invasiveness, metastasis formation and induction of apoptosis. In summary, I have established and applied a high throughput cell-based assay to screen for inducers of apoptosis. Functional characterization of one of the candidates from this screen revealed it to be a disease relevant regulator of cell-cell adhesion. This demonstrates the strength of this high throughput approach in the identification of proteins involved in diseases.

Translation of abstract (German)

Das Ziel dieses Projektes war die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung unbekannter Proteine, die nach Überexpression Apoptose induzieren. Dazu wurde ein zellbasierter Hochdurch-Assay entwickelt, welcher auf der Detektion aktivierter Caspase-3 basiert, nachdem die Zellen Fusionsproteine mit YFP am C- und N-Terminus überexprimierten. Apoptotische Zellen wurden mittels eines spezifischen Antikörpers gegen die aktivierte Form der Caspase-3 detektiert. Der Assay wurde automatisiert und die Datenaufnahme wurde mit einem Durchflußzytometer mit integriertem 96-Well-Platten Lesegerät durchgeführt. Insgesamt wurden 200 Proteine in diesem Assay untersucht, fünf wurden als signifikante Apoptose-Aktivatoren identifiziert. Eines der Kandidaten-Proteine, das Vacuole Membrane Protein 1 (Vmp1), welches nach Überexpression die Bildung von Vakuolen und Apoptose induziert, wurde in Detail untersucht. In vorherigen Untersuchungen war gezeigt worden, dass die VMP1 mRNA in Krebserkrankungen, akuter Pankreatitis und Nieren-Ischämie differentiell exprimiert wird. Das überexprimierte Vmp1-Protein ist im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, die Funktion des Proteins und seine Rolle bei der Entstehung von Krankheiten wurde bis jetzt jedoch nicht untersucht. In der vorliegenden Studie zeigte ich, dass die Bildung der Vakuolen durch die Akkumulation des überexprimierten Vmp1 verursacht wird. Das Protein ist in der Plasmamembran lokalisiert, wo es in die Bildung von initialen Zell-Zell Kontakten involviert ist. Seine Funktion als Zell-Zell-Adhäsions Protein habe ich durch den Nachweis einer direkten Interaktion mit dem Tight Junction-Protein ZO-1 bestätigt. Wird die Expression von Vmp1 mittels spezifischer siRNAs reduziert, verlieren die Zellen ihre Adhäsion und in Nierenkarzinomzellen resultiert die Reduktion in einem deutlichen Ansteigen der Invasivität. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit Ergebnissen der mRNA-Messungen für VMP1, die eine signifikant niedrigere Expression in Nierenkrebs-Metastasen als in primären Nierenkarzinomen zeigen. Diese Resultate zeigen zum ersten Mal, das Vmp1 ein Zelladhäsions-Protein ist, und dass das Maß der Expression ein kritischer Indikator für die Invasivität von Krebszellen, die Bildung von Metastasen und die Auslösung von Apoptose ist. Zusammengefaßt habe ich 200 Proteine auf die Induktion von Apoptose in einem zellbasierten Hochdurchsatz-Assay untersucht. Durch die funktionelle Charakterisierung eines der Kandidaten-Proteine habe ich die Verwendbarkeit des Assays zur Identifizierung krankheitsrelevanter Gene nachgewiesen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wiemann (PD. Dr.), Stefan
Date of thesis defense: 27 September 2006
Date Deposited: 11 Oct 2006 12:43
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Apoptosis, High throughput screening, Durchflusscytometrie, Zellkontakt
Uncontrolled Keywords: Apoptosis , High throughput screening , Flow cytometry , Cell adhesion , Invasion
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