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Functional Aspects of Protein Kinase C FRET Probe Performance

Jost, Christiane

German Title: Funktionelle Aspekte der Leistungsfähigkeit FRET basierender Protein Kinase CSensoren

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Abstract

Understanding cellular signaling pathways and their cross talk increasingly depends on the visualization of their spatio-temporal dynamics. This thesis investigates different factors influencing the performance of two FRET based protein kinase C (PKC) probes, KCP-1 and KCP-2. KCP-1 consists of the truncated PKC substrate pleckstrin, sandwiched between two fluorescent proteins, EYFP and GFP2. KCP-2 is a shortened version of KCP-1, missing the last 18 amino acids of the pleckstrin insert (the acidic loop). The EYFP/GFP2 emission ratio of KCP-1 increases upon phosphorylation, while it decreases in KCP-2. Both probes are reversible. We examined the influence of linker length, charge distribution in particular domains of the probe, and fluorophore dimerization on probe performance. Different FRET pairs, including novel fluorescent proteins and novel labeling techniques, were tested in an effort to vary and optimize the spectral properties of KCP probes. Both probes, KCP-1 and KCP-2, were shown to be sensitive to elongation in their N-terminal linker region. The signal amplitude of the probe was diminished with increasing linker length. Shortening of the same linker region reduced probe performance, although not to the same extent as elongation. This demonstrated the importance of linker length for proper orientation of the fluorophores in the probe molecule. Any changes in the N-terminal PH domain of the pleckstrin insert, for example shortening or replacing basic amino acids with uncharged or acidic residues, had severe impact on probe performance. The direction of the KCP-1 signal was reversed, showing a decrease instead of an increase after phosphorylation. The reversal of signal in KCP-1 probes reflects that specific interactions between the PH domain and the acidic loop are crucial for probe performance. In KCP-2, the impact was less striking, although the signal was reduced. Abolishing the fluorescent proteins' ability to dimerize, led to strongly reduced KCP-2-like signals in both probes. This is the first time that fluorophore dimerization was shown to be essential for the mechanism of action of a genetically encoded sensor. Based on this data, we propose the following models for the mechanism of these PKC probes: In unphosphorylated KCP-2, dimerization of fluorophores serves as a clamp, pulling the two fluorophores together to a closed, quasi cyclized conformation. Phosphorylation of the probe leads to a more open conformation, increasing the average distance between the two fluorophores. This results in a decrease of FRET efficiency after phosphorylation. Two interactions determine the mechanism in KCP-1. Again, the dimerization of the two fluorophores serves as a clamp, pulling the fluorophores to close proximity. An additional interaction between the PH domain and the acidic loop changes the relative orientation of the transition dipole moments in the probe, resulting in a decreased initial FRET efficiency, compared to KCP-2. Phosphorylation of the probe imposes a strain on the intramolecular architecture that rearranges the transition dipoles, leading to an increase in FRET efficiency. The need for a molecular clamp, dimerization of fluorescent proteins in KCP-1 and KCP-2 probes, within the molecule explains why probes containing new monomeric fluorescent proteins or other labels based on full sized proteins did not yield functional sensors. Using the small fluorophore FlAsH, however, we were able to create a smaller sized PKC probe. This probe will allow NMR experiments and structural analysis of a FRET probe for the first time.

Translation of abstract (German)

Die Untersuchung zellulärer Signalwege und deren Wechselwirkungen bedient sich verstärkt Methoden zur Visualisierung räumlicher und zeitlicher Dynamik. In dieser Dissertation werden verschiedenen Faktoren untersucht, die die Leistungsfähigkeit zweier auf FRET basierender Sensoren für Protein Kinase C beeinflussen (KCP-1 und KCP-2). KCP-1 besteht aus einer verkürzten Form des PKC Substrats Pleckstrin und den fluoreszenten Proteinen, EYFP und GFP2, die an den N- bzw. den C-Terminus von Pleckstrin gesetzt wurden. KCP-2 ist eine verkürzte Version von KCP-1, bei der die letzten 18 Aminosäuren des Pleckstrins („acidic loop“) entfernt wurden. Das Verhältnis der Emissionen von EYFP und GFP2 nimmt zu, wenn KCP-1 phosphoryliert wird, während es bei KCP-2 abnimmt. Beide Sensoren sind komplett reversibel. Wir haben den Einfluss der Länge von verbindenden Sequenzen, von Ladungsverteilungen in bestimmten Domänen des Sensors, und von der Dimerisierung der Fluorophore untersucht. Die Verwendung neuer fluoreszenter Proteine und Markierungstechniken wurde untersucht, um die spektralen Eigenschaften in KCP Proben zu optimieren und zu variieren. Beide Sensoren, KCP-1 und KCP-2, zeigten veränderte Signalamplituden, wenn ihre N-terminale Verbindungsregion verlängert wurde. Mit zunehmender Länge der eingefügten Sequenz nahm die Amplitude des Signals ab. Eine Verkürzung der gleichen Region hatte einen ähnlichen Effekt, wenn auch weniger stark ausgeprägt. Dies zeigt die Bedeutung der Länge von Verbindungssequenzen für die richtige Orientierung der Fluorophore im Sensor-Molekül. Jede Veränderung in der N-terminalen PH-Domäne, z.B. Verkürzung der Domäne oder der Austausch basischer mit neutralen oder sauren Aminosäuren, hatte einen großen Einfluss auf das Verhalten der Sensoren. Die Richtung des KCP-1 Signals kehrte sich um. Anstelle eines ansteigenden Verhältnisses der EYFP/GFP2 Emissionen, wurde jetzt ein abnehmendes gemessen. Die Umkehrung des KCP-1 Signals verdeutlicht, daß durch die Mutationen eine spezifische Bindung zwischen der PH-Domäne und dem „acidic loop“ zerstört wurde. In KCP-2 war der Effekt von Mutationen in der PH-Domäne weniger ausgeprägt, aber die Signalamplitude war deutlich herabgesetzt. Wurde die Dimerisierung der fluoreszenten Proteine verhindert, führte dies zu einem stark reduzierten Signal mit KCP-2-ähnlichem Verlauf. Die ist das erste mal, dass gezeigt werden konnte, dass die Dimerisierng für die Funktion eines genetisch kodierten Sensors essentiell ist. Ausgehend von diesen Daten, schlagen wir den folgenden Mechanismus für die Funktion der KCP Proben vor: Im unphosphorylierten KCP-2 Molekül wirkt die Dimerisierung der fluoreszenten Proteine wie eine Klammer, die diese zusammenhält und zu einer quasi-zyklischen Struktur führt. Die Phosphorylierung erzeugt eine offene Konformation, mit einem vergösserten durchschnittlichen Abstand der Fluorophore. Dies verringert die FRET-Effizienz nach der Phosphorylierung. In KCP-1 sind zwei Wechselwirkungen für den Mechanismus verantwortlich. Die Dimerisierung der beiden Fluorophore wirkt wieder als Klammer, die die Fluorophore näher zusammen zieht. Die zusätzliche Wechselwirkung zwischen der PH- und der DEP-Domäne sorgt allerdings für eine andere Orientierung der Übergangsdipolmomente der Fluorophore, welches die anfängliche FRET-Effizienz im Vergleich zu KCP-2 herabsetzt. Durch die Phosporylierung wird eine zusätzliche Spannung in das Molekül eingeführt, die für eine Reorientierung der Übergangsdipolmomente und einer vergrößerten FRET-Effizienz führt. Die Notwendigkeit einer molekularen Klammer innerhalb des Moleküls, wie zum Beispiel die Dimerisierung der Fluorophore, erklärt, weshalb Sensoren mit neuen monomeren Fluorophoren oder Markierungstechniken nicht funktionell waren. Mit dem kleinen Fluorophor FlAsH gelang es, einen neuen PKC Sensor zu entwickeln, der klein genug ist, um zum ersten Mal NMR Strukturstudien an einer auf FRET basierenden Probe durchzuführen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Conti, Dr Elena
Date of thesis defense: 5. October 2006
Date Deposited: 11. Oct 2006 07:52
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, Grün fluoreszierendes Protein, Signaltransduktion
Uncontrolled Keywords: Fluoreszente Proben , Protein Kinase CFRET , probe development , GFP , Signal Transduction
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