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Funktionelle Charakterisierung der humanen Proteinkinase Aurora-C in Krebszellen

Spengler, Daniel

English Title: Functional Characterisation Of The Human Protein Kinase Aurora-C In Cancer Cells

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PDF, German
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Abstract

Aurora-Kinasen sind eine konservierte Familie von Serin/Threonin-Kinasen, die an der Regulation der Mitose und Meiose in eukaryotischen Organismen beteiligt sind. Die Aurora-Subfamilie in Säugern besteht aus drei Kinasen, die Aurora-A, -B und -C bezeichnet werden. Im Gegensatz zu Aurora-A und -B sind die physiologischen Funktionen der Kinase Aurora-C unbekannt. Aurora-Kinasen vom Typ C konnten bisher nur in Säugerzellen nachgewiesen werden. Die Expression der Kinase scheint sich dabei auf die männlichen und weiblichen Keimdrüsen sowie bestimmte Krebszelllinien und Tumoren zu beschränken. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der humanen Proteinkinase Aurora-C in Krebszellen. Die Untersuchung verschiedener Aurora-C-Derivate im Rahmen dieser Arbeit hat gezeigt, dass die Mutante Aurora-C-T191D im Vergleich zu anderen Aurora-C-Derivaten (WT, K72R T198D, T202D) eine erhöhte Kinaseaktivität in vitro aufweist und als hyperaktiv bezeichnet werden kann. Die proteinchemische Untersuchung der hyperaktiven Mutante Aurora-C-T191D hat außerdem ergeben, dass das überexprimierte Protein in HeLa-Zellen posttranslational modifiziert wird. Die physiologischen Auswirkungen dieser Modifikation sind allerdings unbekannt. Die weiteren Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit haben gezeigt, dass der Kinase Aurora-C eine Funktion bei der Regulation der Zellmorphologie in Epithelzellen zukommt. Die Behandlung von HeLa-Zellen mit shRNAs gegen Aurora-C und die Überexpression der hyperaktiven Mutante Aurora-C-T191D in HeLa-Zellen bewirken den Verlust des cytoplasmatischen Raums und der Zellpolarität in den betroffenen Zellen. Ein weiterer Schwerpunkt im Rahmen dieser Arbeit bildete die Identifizierung von Interaktionspartnern der Kinase Aurora-C durch einen Two-Hybrid-Screen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Unter anderem wurden drei Proteine (Calpain-4, Epiplakin, Interleukin 15) identifiziert, die wie Aurora-C eine Veränderung der Zellmorphologie bewirken können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde von den drei Proteinen allerdings nur Calpain-4 näher unter-sucht. Es konnte gezeigt werden, dass Calpain-4 in vitro kein Substrat der Kinase Aurora-C ist und dass die beiden Proteine nach Überexpression spezifisch im Zellkern, an der postmitotischen Brücke und am Zellrand kolokalisieren. Ein weiteres Protein, das im Two-Hybrid-Screen identifiziert wurde, ist das Telomerbindeprotein TRF2. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kinase Aurora-C das Substrat TRF2 in vitro an der Position Threonin 358 spezifisch phosphorylieren kann.

Translation of abstract (English)

Aurora kinases are a family of highly conserved Serine/Threonine kinases, involved in the regulation of mitosis and meiosis in all eukaryotes. In mammals, the Aurora subfamily constitutes three kinases: Aurora-A, Aurora-B and Aurora-C. Aurora-A is implicated primarily in centrosome maturation and microtubule nucleation, whereas Aurora-B is proposed to regulate cytokinesis, the spindle assembly checkpoint, chromosome condensation and segregation. In contrast, the function of Aurora-C is poorly understood. Aurora-C has been so far only described in mammalian cells. The expression of Aurora-C is restricted to testis and certain tumour cell lines. In our studies, we have undertaken a functional analysis of the human protein kinase Aurora-C in cancer cell lines. Mutational analysis of human Aurora-C revealed that the Aurora-C-T191D mutant is hyperactive. The kinase activity of Aurora-C-T191D is increased compared to other Aurora-C derivates (WT, T198D, T202D, K72R). In addition, the expression of Aurora-C-T191D in HeLa cells causes a posttranslational modification of the protein. The physiological consequences of the modification remain unclear. RNA interference, as well as ectopic expression of Aurora-C demonstrated that Aurora-C takes part in the regulation of the cell morphology in epithelial cells. The overexpressions of the hyperactive Aurora-C-T191D mutant and silencing of Aurora-C by shRNA result in a loss of cytoplasm and cell polarity in HeLa cells. In our studies, we performed a yeast two-hybrid to identify potential Aurora-C interacting proteins. We identified three proteins (Calpain-4, Epiplakin, Interleukin-15) involved in the regulation of cell morphology. Further studies showed that in vitro Calpain-4 is not a substrate for the kinase Aurora-C. When co-overexpressed, both proteins co-localize specifically in the cytoplasm, at the post mitotic bridge and at the cell membrane. Another potential Aurora-C interacting protein identified in the two-hybrid-screen, was the telomere-binding protein TRF2. Mutational analysis showed that Aurora-C phosphorylates TRF2 specifically on Threonine 358 in vitro.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hoffmann, Priv.-Doz Ingrid
Date of thesis defense: 9 November 2006
Date Deposited: 14 Nov 2006 11:47
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Kinasen, Cytologie, Molekularbiologie, Zellteilung, Mitose
Uncontrolled Keywords: Aurora-C , Zellmorphologie , ZellwachstumAurora-C , cell morphology , cell growth
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