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Molekulares Tuning des Aktin-Myosin-Motors : Entwicklung und Anwendung eines Motility Assays zur Messung maximaler Verkürzungsgeschwindigkeiten intakter Muskelfasern in einem in vitro Modell

Ober, Tobias

English Title: Molecular Tuning of the Actin-Myosin-Motor : Development and application of a motility assay for measurement of maximum speed of shortening of an intact muscle fiber in an in vitro model

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PDF, German
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Abstract

Das Motility Assay ist ein in vitro Modell zur Visualisierung der Bewegung von einzelnen Aktinmolekülen über eine myosinbedeckte Oberfläche mittels Epifluoreszenzmikroskopie. Als einfachstes Muskelmodell war es damit bisher jedoch nicht möglich, die eklatante Diskrepanz zwischen in vivo und in vitro Ergebnissen zu erklären. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es deshalb, ein verbessertes Modell zu entwickeln, das es ermöglicht, Bewegungsabläufe in Muskelzellen mit guter physiologischer Übereinstimmung darzustellen. Hierzu wurde das in vitro Motility Assay verwendet, das durch Einführung neuer präparativer Techniken, computergestützter Messmethoden und Kombination mit regulativen Proteinen erstmals in der Lage war, Verkürzungsgeschwindigkeiten von intakten isolierten Myocythen im Modell in sehr guter Näherung nachzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Herstellung der biochemischen Komponenten für den Aufbau einer Optische Falle zur Messung von Kraftereignissen im Pikonewtonbereich, die die Ergebnisse des Motility Assays dahingehend ergänzen sollen, dass nicht nur Aussagen zur Geschwindigkeit, sondern auch zur calciumabhängigen Kraftentwicklung erhalten werden können. Als Beispiel einer klinischen Fragestellung wurde der Einfluss eines mit Motorproteinen interagierenden Proteinfragments (sNC2-Fragment des MyBP-C) getestet. Es konnte gezeigt werden, dass (i) es mit dem neuen Modell möglich ist, Interaktionen zwischen Proteinen oder Substanzen mit den Motorproteinen zu quantifizieren und (ii) das Modell in der Lage ist, für bestimmte Anwendungen Muskelpräparate zu ersetzen.

Translation of abstract (English)

The motility assay is an in vitro model for visualizing the motion of actin filaments over myosin covered surfaces using fluorescence microscopy. Up to now this simplest muscle model has had difficulties to explain the blatant discrepancy in results between in vivo and in vitro results. The main aim of this thesis was the development of an improved model which is able to reproduce shortening velocities in muscle cell as physiologically as possible. For this purpose, an improved motility assay was used. By implementing new preparative techniques, computer based measurement methods and the combination with regulative proteins it was possible for the first time to generate shortening velocities of intact muscle fibers in a molecular in vitro model. An other aim of this studies was the production of biochemical compounds for the optical tweezers setup for force measurements in the range of pikonewton. The results of these measurements should complete the results of motility assay experiments by allowing not only conclusions over velocity but also information about calcium dependant force development. As an example for a clinically relevant question the influence of a with motor proteins interacting protein fragment (sNC2-fragment of MyBP-C) was tested. It could be demonstrated that (i) this new model is able to quantify interactions among proteins or substances with motorproteins and (ii) for some specific applications, the model can substitute muscle preparations.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Rainer H. A. Fink, Prof.
Date of thesis defense: 13 November 2006
Date Deposited: 29 Nov 2006 15:19
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Muskelproteine, Actin, Actin-Filament, Actomyosin, Myosin, Motilität
Uncontrolled Keywords: motility assay , actin , myosin , single fibre
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