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Herstellung und funktionelle Analyse von Immunzytokinen, die Interleukin-2 (IL-2) oder Granulozyten/Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) enthalten, zur Verbesserung einer NDV-modifizierten Tumorvakzine

Aigner, Maximilian

English Title: Production and functional analysis of immunocytokines containing interleukin-2 (IL-2) or granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) for the improvement of a NDV-modified tumor vaccine

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Abstract

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Herstellung und funktionellen Analyse neuartiger, IL-2- bzw. GM-CSF-enthaltender bi- und trispezifischer single-chain Antikörper (Immunzytokine) zur Verbesserung der antitumoralen Immunantworten bei Krebspatienten. Die Arbeit ist thematisch in ein Projekt zur Entwicklung einer aktiv-spezifischen Immuntherapie (ASI) von Tumoren eingebunden. Bei dieser Therapie werden inaktivierte, autologe Tumorzellen (aus dem chirurgisch entfernten Primärtumor des Patienten) mit dem Newcastle Disease Virus (NDV, Stamm Ulster) infiziert und die so hergestellten autologen Tumorvakzinezellen (ATV-NDV) dem Patienten nach einem bestimmten Schema geimpft. Die beiden schon beschriebenen bispezifischen, rekombinant hergestellten Konstrukte bs HN-CD3 und bs HN-CD28 sind so beschaffen, dass sie mit einem Arm an das virale Antigen Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) auf der Oberfläche der Vakzinezellen binden. Der zweite Arm hingegen ist entweder gegen das T-Zell-Rezeptor-assoziierte CD3-Molekül oder gegen den kostimulatorisch wirkenden CD28-Rezeptor gerichtet. Diese zwei Signale rekrutieren und aktivieren T-Zellen am Ort der applizierten Vakzine. Die in dieser Arbeit vorgestellten bi- und trispezifischen Antikörper enthalten darüber hinaus die Zytokine IL-2 und/oder GM-CSF und sollen durch das Einbringen zusätzlicher immunstimulierender Signale die Wirkung der Vakzine verbessern. Zunächst konnte demonstriert werden, dass es möglich war, die neuen Antikörper stabil in CHO Zellen zu produzieren. Die aufgereinigten Antikörper, die nicht nur gegen HN, sondern auch gegen das virale Fusionsprotein (F0) gerichtet sein können, wiesen alle Bindungseigenschaften und biologischen Aktivitäten auf, um stimulierend wirken zu können. In Gegenwart eines suboptimalen CD3-Signals induzierten Antikörper, die zusätzlich zum CD28-Signal einen IL-2-Zytokinanteil aufwiesen, eine stärkere und länger anhaltende Aktivierung von T-Zellen, welche aus mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMZ) gesunder Spender isoliert wurden, als die Verwendung von CD28-Signal oder IL-2 alleine. Diese verstärkte antitumorale Wirkung konnte in dem neu etablierten in vitro Tumor-Neutralisations-Assay (TNA) nachgewiesen werden. V.a. naive T-Zellen, die im Gegensatz zu Gedächtnis-T-Zellen noch keinen antigenspezifischen Kontakt durchlaufen haben, ließen sich durch diese neuartigen Antikörper stark stimulieren und besaßen zytotoxische Aktivität. Neu in diesem Zusammenhang war, dass IL-2 eine vergleichbare kostimulatorische Wirkung auf die Aktivierung naiver T-Zellen ausübte wie das CD28-Signal. Zudem wurde nachgewiesen, dass CD14+ Monozyten durch GM-CSF-enthaltende Fusionsproteine aktiviert werden konnten und im TNA zum Antitumor-Effekt beitrugen. Die Ergebnisse dieser Dissertation lassen insgesamt darauf schließen, dass die klinische Anwendung einer Kombinationstherapie – als eine Erweiterung der Grundvakzine ATV-NDV durch Anbindung von CD3- und CD28-Signalen zusammen mit IL-2- und GM-CSF-enthaltenden Immunzytokinen – vielversprechend ist.

Translation of abstract (English)

The presented thesis deals with the production and functional analysis of new IL-2 or GM-CSF containing bi- and trispecific single-chain antibodies (immunocytokines) for the improvement of antitumoral immune responses in cancer patients. Thematically, this work is involved in a project concerning the development of an active-specific immunotherapy (ASI) against tumors. As part of this therapy, inactivated, autologous tumor cells (deriving from the surgically resected patient’s primary tumor) are infected with the Newcastle Disease Virus (NDV, strain Ulster), before the autologous tumor vaccine cells (ATV-NDV) are transferred back into the patient following a specific protocol. The two bispecific constructs bs HN-CD3 and bs HN-CD28, produced by recombinant technology, have already been described and are made in such a way that they bind with one arm to the viral antigen hemagglutinin-neuraminidase (HN) on the surface of the vaccine cells. The second arm, however, is directed either against the CD3 molecule, which is associated with the T-cell receptor, or against the costimulatory CD28 receptor. Both signals recruit and activate T-cells at the vaccination site. The bi- and trispecific antibodies presented in this work additionally contain the cytokines IL-2 and/or GM-CSF and therefore, by introducing supplementary immunomodulating signals, they should improve the efficacy of the vaccine. At first, it was demonstrated that the stable production of the new antibodies in CHO cells was possible. The purified antibodies, which can be directed against both HN and the viral fusion protein (F0), showed all binding characteristics as well as biological activities to ensure their stimulation capacities. In the presence of a suboptimal dose of the CD3 signal, antibodies with an IL-2 cytokine portion in addition to the CD28 signal induced a stronger and more prolonged activation of T-cells, which were isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy donors, than the CD28 signal or IL-2 alone. This improved antitumoral effect was demonstrated using the newly established in vitro tumor neutralisation assay (TNA). Especially naive T-cells, which in contrast to memory T-cells have not yet met their cognate antigen, were strongly stimulated by these new antibodies and were cytotoxic. In this context, a new aspect was the finding that IL-2 had a similar impact on naive T-cell costimulation as the CD28 signal. Furthermore, it was shown that CD14+ monocytes could be activated by GM-CSF containing fusion proteins and that they contributed to the antitumor effect in the TNA. In conclusion, the data presented in this thesis suggests that the clinical application of a combined therapy – as an extension of the basic vaccine ATV-NDV by attachment of CD3 and CD28 signals together with IL-2 and GM-CSF containing immunocytokines – is promising.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schirrmacher, Prof. Dr. Volker
Date of thesis defense: 20 June 2006
Date Deposited: 08 Jan 2007 13:55
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: NDV , Tumorvakzine , IL-2 , GM-CSF , Kostimulation
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