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Generation of genetically modified mice with conditional alleles of Dyrk1a : a minimal animal model of Down syndrome

Beck, Claus

German Title: Herstellung genetisch modifizierter Mäuse mit konditionalen Allelen von Dyrk1a : ein minimales Tiermodell für das Down Syndrom

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PDF, German
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Abstract

Down Syndrom (Trisomie 21) ist die Hauptursache für geistige Behinderung. Die “Down Syndrom kritische Region“ auf dem menschlichen Chromosom 21 ist ausschlaggebend für die Trisomie 21-assoziierte geistige Behinderung und für die Monosomie 21-assoziierte Mikrocephalie. Unter den bisher ungefähr zwei Dutzend identifizierten Genen in dieser Region, ist DYRK1A ein viel versprechendes Kandidatengen für die zahlreichen neurobiologischen Veränderungen. DYRK1A ist über viele Arten hinweg stark konserviert, ubiquitär exprimiert und kodiert für eine Serin/Threonin Kinase. Einige potentielle Substrate von DYRK1A konnten identifiziert werden und transgene DYRK1A Mäuse deuten darauf hin, dass dieses Gen an Lern- und Gedächtnisprozessen beteiligt ist. Bisher konnten aber die meisten grundlegenden molekularen Mechanismen und die physiologische Funktion von DYRK1A nicht geklärt werden. Um einen Einblick in die physiologische Rolle von DYRK1A zu erhalten, haben wir uns entschlossen die embryonale Letalität des konventionellen Knockouts zu umgehen, indem wir das konditionelle Cre/loxP Rekombinationssystem nutzten. Die neue Technik des „Recombineering“ ermöglichte eine schnelle und effiziente Herstellung von Mäusen mit einem loxP flankierten Dyrk1a Allel. Die heterozygoten Dyrk1a(flox/+) Mäuse und die homozygoten Dyrk1a(flox/flox) Mäuse sind lebensfähig und sie zeigen bisher keine großen anatomischen Unterschiede im Vergleich zu Wildtyptieren auf. Zudem konnten wir durch eine RNA Analyse zeigen, dass die eingefügten loxP Seiten keinen Einfluss auf die Transkription des gefloxten Dyrk1a Allels haben. Der spezifische Knockout im Bereich des Vorderhirns wurde durch Verpaarung mit CaMKIIa-Cre Mäusen hergestellt. Wir konnten erfolgreich einen heterozygoten Dyrk1a(del/+) Knockout im Vorderhirn erzeugen aber bisher konnten wir keinen lebensfähigen homozygoten Dyrk1a(del/del) Knockout im Vorderhirn herstellen. In einem parallelen Experiment wollten wir die Überexpression von Dyrk1a im Down Syndrom durch die Herstellung einer konditionalen Tet-induzierbaren Dyrk1a Maus nachahmen. Daher haben wir uns für einen neuen transgenen Ansatz entschieden. Anstatt transgene Tiere durch Zufallsintegration des tetO-Dyrk1a Transgens herzustellen, wurde der stille aber hochaktivierbare LC1 Lokus angesteuert, der von K. Schönig im Labor von H. Bujard identifiziert wurde. Für das Gene Targeting in ES Zellen konnte der erste generelle Targeting Vektor für den LC1-Lokus erfolgreich hergestellt werden. Anschließend haben wir Mäuse mit einem LC1-Lokus spezifischen, tet-kontrollierten Dyrk1a Allel generiert. Das Allel beinhaltete ein bidirektionales tetO-Dyrk1a/Egfp Transgen in diesem Lokus. Die konditionale Expression von Dyrk1a und dem Reportergen Egfp konnte durch Verpaarung mit CaMKIIa-tTA Mäusen gezeigt werden. In diesen doppeltransgenen Mäusen wird Dyrk1a und Egfp im Vorderhirn exprimiert, entsprechend dem Expressionsmuster des CaMKIIa Promotors, der die Expression von tTA steuert. Beide genetisch veränderten Mauslinien stellen ein großes Potential für die weiteren Untersuchungen der pleiotropen Effekte von Dyrk1a in der komplexen Pathophysiologie des Down Syndroms und der Monosomie 21-assoziierten intrauterinen Mikrocephalie dar.

Translation of abstract (English)

Down syndrome (trisomy 21) is the major cause of mental retardation. The “Down syndrome critical region” of human chromosome 21 is crucial for both trisomy related mental retardation and monosomy related microcephaly. Among the about two dozen genes identified in this region, DYRK1A is a promising candidate gene for the numerous neurobiological alterations. DYRK1A is highly conserved across species, ubiquitously expressed and encodes for a serine/threonine kinase. Several putative substrates of DYRK1A are identified and transgenic DYRK1A mice suggest that it is involved in learning and memory, but so far most of the underlying molecular mechanisms and the physiological functions of DYRK1A remain unclear. To gain insight into the physiological role of DYRK1A we decided to circumvent the embryonic lethality of the conventional knockout by applying the conditional Cre/loxP recombination system. The new technique of recombineering allowed for a rapid and efficient generation of mice with a loxP flanked Dyrk1a allele by gene targeting. Heterozygous Dyrk1a(flox/+) and homozygous Dyrk1a(flox/flox) mice are viable and do not show so far any gross anatomic differences compared to wildtype animals. Furthermore RNA analysis revealed no effect of the inserted loxP sites on the transcription of the floxed Dyrk1a allele. The forebrain-specific conditional knockout of Dyrk1a was generated by crossing in CaMKIIa-Cre mice. We successfully generated forebrain-specific heterozygous Dyrk1a(del/+) knockout mice but to this point we could not generate viable homozygous Dyrk1a(del/del) knockout mice. In a parallel experiment we wanted to mimic the overexpression of Dyrk1a in Down syndrome by generating a conditional Tet-inducible Dyrk1a transgenic mouse. Thus we further developed a novel transgenic approach. Instead of using random integration transgenesis for the tetO-Dyrk1a constructs, we targeted the silent but highly activatable (s/a) locus LC1 identified by K. Schönig in the laboratory of H. Bujard. For gene targeting in ES cells, we successfully constructed the first general targeting vector for the LC1 locus. We subsequently generated mice with a LC1 locus-specific tet-controlled Dyrk1a allele, carrying a bidirectional tetO-Dyrk1a/Egfp transgene in this locus. The conditional expression of Dyrk1a and the reporter gene Egfp was demonstrated by crossing in CaMKIIa-tTA mice. In these double transgenic mice Dyrk1a and Egfp are expressed in the forebrain according to the expression of the CaMKIIa promoter which drives the expression of tTA. Both genetically modified mouse lines offer a great potential for further investigation of the pleiotropic effects of Dyrk1a in the complex pathophysiology of Down syndrome and monosomy 21-associated intrauterine microcephaly.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Seeburg, Prof.Dr. ) Peter H.
Date of thesis defense: 20. December 2006
Date Deposited: 21. Dec 2006 14:42
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Zentralinstitut für Seelische Gesundheit
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Down-Syndrom, Transgene Tiere, Tetracycline, Recombinasen, Genregulation
Uncontrolled Keywords: Konditionale Genexpression , Cre Rekombinaseconditional gene expression , Cre recombinase
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