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Die Rolle der 14-3-3-Proteine beim Vorwärtstransport von Kaliumkanälen

Heusser, Katja

English Title: The role of 14-3-3 proteins at the forward transport of potassium channels

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PDF, German
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Abstract

Kaliumkanäle, die wie andere Ionenkanäle und Membrantransportproteine ein wichtiges Bindeglied zwischen dem extrazellulären bzw. luminalen Raum und dem Zellinneren darstellen, spielen eine Rolle in diversen zellulären Prozessen wie Aufrechterhaltung des Membranpotentials, Frequenz und Verlauf von Aktionspotentialen, Sekretion und Signaltransduktion. Sie bilden temporär Poren in der Membran, durch die hochselektiv Kaliumionen entlang eines elektrochemischen Gradienten transportiert werden können. Ihre Einbindung in zahlreiche physiologische Prozesse impliziert ihre strikte Regulation auf mehreren Ebenen, angefangen bei der Gewebe-spezifischen Expression über die Kontrolle der Kopienzahl am Ort ihrer Aktivität, bis hin zu den Regulationsmechanismen der Öffnungswahrscheinlichkeit der Pore und der Ionenselektivität. Ein funktioneller Kaliumkanal wird durch die Zusammenlagerung von homomeren oder heteromeren Untereinheiten gebildet, wobei bis zu vier primäre oder !-Untereinheiten den Kanal bilden und mit weiteren akzessorischen bzw. "-Untereinheiten assemblieren können. Für die Funktionalität von pankreatischen ATP-sensitiven Kaliumkanälen ist eine stöchiometrisch korrekte Assemblierung der beiden Untereinheiten Kir6.2 und SUR1 essentiell. Vier Kanal-bildende Untereinheiten Kir6.2 müssen sich mit vier regulatorischen SUR1-Untereinheiten zu einem Oktamer zusammenlagern, damit der am Prozess der Insulinsekretion beteiligte Kaliumkanal zur Plasmamembran transportiert werden kann. Die Regulation auf der Ebene der Assemblierung erfolgt durch die Anwesenheit von ER-Lokalisationssignalen in den zytosolischen Domänen beider Proteinuntereinheiten. Diese Arginin-haltigen Motive (RKR) werden von zwei gegensätzlich wirkenden Interaktionspartnern erkannt: Einzelne bzw. unvollständig oder falsch zusammengelagerte Untereinheiten werden durch die COPI-Maschinerie zum ER zurückgeführt, während zytosolische 14-3-3-Proteine am Vorwärtstranport zur Plasmamembran beteiligt sind. Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass 14-3-3-Proteine nicht nur spezifisch Kir6.2-Reporterproteine binden können, sondern dass diese Proteine am Transport des vollständigen, heterooktameren KATP-Kanalkomplexes beteiligt sind. Die Interaktion ist dabei eng an den Multimerisierungsstatus gekoppelt und involviert Aminosäurebereiche außerhalb der ER-Lokalisationssequenz in Kir6.2. Dabei ist die Aufgabe der 14-3-3-Proteine letztlich die Inaktivierung der Arginin-Signale in der Untereinheit SUR1, denn die Signale von Kir6.2 werden durch die korrekte Assemblierung mit SUR1 maskiert. Die 14-3-3-Proteine dienen dabei ausschließlich der Qualitätskontrolle und spielen keine Rolle beim Vorwärtstransport per se, denn sie haben keinen Einfluss auf den Transport des Kanals zur Zelloberfläche, wenn alle acht ER-Lokalisationssignale im KATP-Komplex mutiert sind. Die Untersuchung eines Kir6.2-Reporterproteins in Bäckerhefezellen, in denen jeweils nur eine von den insgesamt sieben Säuger-14-3-3-Isoformen exprimiert wird, deuten auf eine 14-3-3-Isoform-Spezifität beim Vorwärtstransport von Membranproteinen hin. So ist denkbar, dass verschiedene 14-3-3-Isoformen den Transport pankreatischer KATP-Kanäle in verschiedene Kompartimente regulieren, da diese offensichtlich hauptsächlich in Insulin-enthaltenden sekretorischen Vesikeln und nur in geringer Kopienzahl an der Plasmamembran präsent sind. Eine vergleichbare Aufgabe in der Qualitätskontrolle nehmen 14-3-3-Proteine bei den Zwei-Poren-Kaliumkanälen TASK1 und TASK3 ein. Hier erkennen 14-3-3-Proteine ein neu entdecktes Arginin-haltiges ER-Lokalisationssignal im C-Terminus der Kanalproteine und sind wie bei KATP-Kanälen für die Inaktivierung dieses Signals verantwortlich, woraufhin die Kanäle an die Plasmamembran transportiert werden können.

Translation of abstract (English)

Potassium channels connect inside and outside of a cell like other ion channels or membrane transport proteins. Potassium channels play a role in diverse processes like stabilizing the membrane potential, frequency and duration of action potentials, secretion and signal transduction. Through temporally open pores in the lipid bilayer potassium ions are conducted with high selectivity along the electrochemical gradient. Their involvement in physiologically important processes implicates strict regulation like tissues-specific expression, copy number in membranes, open probability and ion selectivity. Functional potassium channels are formed by assembly of two to four !-subunits which can further coassemble with "-subunits. Heterologous expression of Kir6.2 in pancreatic "-cells alone does not result in functional channel activity of ATP-sensitive Potassium channels involved in insulin secretion. Each of these proteins requires an additional SUR1 subunit, which coassembles with Kir6.2 in a 4:4 stoichiometry to form an octameric channel complex. This is regulated by Arginine-based ER localisation signals present in the cytosolic domains of both channel subunits. These signals are recognized by either COPI components or 14-3-3 proteins, returning incorrectly assembled complexes and single subunits back to the ER, promoting forward transport of correctly assembled channel complexes respectively. This work provides evidence for the involvement of 14-3-3s not only in the forward transport of Kir6.2 reporter proteins but in the transport of the whole KATP channel complex to the cell surface. Interaction strictly depends on multimerization of the subunits and on aminoacid residues beside the RKR sequence of Kir6.2 protein. The Arg-based signal present in Kir6.2 is sterically masked by the SUR1 subunit. In contrast, 14-3-3 proteins functionally antagonize the Arg-based signal present in SUR1. They do not appear to have a positive effect on forward trafficking per se, because they have no effect on surface expression when all eight of the Argbased ER localization signals present in KATP-complex are mutated. Trafficking studies of a multimeric Kir6.2 yeast reporter in yeast strains of different genetic backgrounds (only one of seven mammalian 14-3-3 isoforms expressed) point towards isoform specificity of the role of 14-3-3s in membrane protein trafficking. Different 14-3-3 isoforms could regulate forward transport of KATP into different compartments since the secretory granule membrane is the major site of KATP channels in pancreatic "-cells and only a few copies reside on the plasma membrane. 14-3-3 proteins do also count for the forward transport of other proteins like K2P channels TASK1 and TASK3. Here they seem to inactivate a recently identified ER localisation signal present in the distal C-terminal tail of the two pore potassium channels.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Blanche Schwappach, PD
Date of thesis defense: 18 December 2006
Date Deposited: 11 Jan 2007 11:50
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Membranproteine, Intrazellulärer Transport, Plasmamembran, Qualitätskontrolle
Uncontrolled Keywords: ER-Retentionssignal , Multimer , Kaliumkanäle , OberflächenexpressionER retention , forward transport , potassium channels , quality control , multimer
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