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Anbindung und Aufnahme von Hitzeschockprotein-Antigenkomplexen durch Antigenpräsentierende Zellen

Zitzler, Sandra

English Title: Binding and uptake of heat shock protein-antigen complexes by antigen presenting cells

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Abstract

Hsp70 sowie verschiedene andere molekulare Chaperone finden mehr und mehr einen wirkungsvollen Einsatz in der Tumortherapie. Dabei kommt Hsp70 eine wesentliche Rolle als Adjuvans in der Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen (APCs) und der Kreuzpräsentation extrazellulärer Antigene auf MHC-I Molekülen zu. Für die Bindung und Aufnahme von Hsp70 gebundenem Antigen wurden verschiedene Rezeptoren auf der Zelloberfläche antigenpräsentierender Zellen postuliert. CD91 wurde als erster Zelloberflächenrezeptor für die Hitzeschockproteine Hsp90, GRP94, Hsp70 und Calreticulin auf Raw264.7 Zellen beschrieben. Unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen exprimierten Raw264.7 Zellen sowohl vor als auch nach LPS Stimulation funktionelles CD91, wobei die Fähigkeit Hsp70 zu binden nach Stimulation verloren ging. Konträr zu den bereits publizierten Daten exprimierten unstimulierte Raw309 Cr.1 Zellen funktionelles CD91 ohne jedoch Hsp70 spezifisch zu binden, wohingegen nach LPS Stimulation eine spezifische Hsp70 Anbindung beobachtet wurde. CHO Zellen, die funktionelles CD91 überexprimierten, zeigten keine spezifische Bindung von Hsp70. Für humanes und mykobakterielles Hsp70 wurden neben CD91 die Zelloberflächenrezeptoren LOX 1 und CD40 beschrieben. Unter Verwendung für CD40 und LOX 1 spezifischer Liganden konnte in Kompetitionsexperimenten an Raw264.7 Zellen weder eine Inhibierung der N70 noch eine Inhibierung der C70 Anbindung festgestellt werden. Zusammenfassend können daher anhand der vorliegenden Daten die beschriebenen Rezeptoren CD91 sowie LOX-1 in dem verwendeten System als HSP70 Rezeptoren ausgeschlossen werden. Hinsichtlich des CD40 Rezeptors konnte keine Inhibierung der Subdomänen von Hsp70 unter Verwendung des CD40 Antikörpers beobachtet werden. Folglich kommt das Epitop, welches vom CD40 Antikörper erkannt wird, nicht als putative Bindungsstelle für Hsp70 in Frage. Darüber hinaus geht eine erhöhte Expression von CD40 auf der Plasmamembran von Raw264.7 Zellen nicht mit einer verstärkten Anbindung von Hsp70 einher, was CD40 als “Massenrezeptor“ in diesen Zellen mit großer Wahrscheinlichkeit ausschließt. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen die Existenz mehrerer, mindestens aber von zwei Rezeptoren für Hsp70, wobei diese Rezeptoren unterschiedliche Domänen des Hsp70 Moleküls erkennen. Raw264.7 Zellen, aber auch D2.4 Zellen binden den Hsp70 Antigen Komplex an bestimmten Bereichen der Zelloberfläche. Dabei erfolgt die spezifische Bindung der Untereinheiten C70 und N70 an deutlich voneinander getrennten Mikrodomänen auf der Zelloberfläche, wobei C70 an Detergens-resistente Domänen und N70 außerhalb dieser Bereiche bindet. Unter physiologischen Bedingungen (37°C) wird der Hsp70 Antigen Komplex rasch und effizient aufgenommen, wobei früh eine Trennung von beladenem und unbeladenem Hsp70 stattfindet. Kurz nach der Aufnahme des Hsp70-Antigen Komplexes lokalisiert beladenes Hsp70 in Rab5 positiven retikulären Strukturen, wo es auch im beobachteten Zeitraum auch verbleibt, wohingegen unbeladenes Hsp70 nach 20 min in lysosomalen Kompartimenten zu finden ist. Letztlich konnte mit Hilfe des CD8+ T-Zell Hybridom System B3Z gezeigt werden, dass Hsp70 aber auch C70 assoziiertes Antigen effektiv auf MHC-Klasse I Molekülen kreuzpräsentiert wird, d.h die beobachtete Bindung und Internalisierung funktionell für die Kreuzpräsentation ist. Die Anbindung von N70 führt hingegen zu einer erhöhten makropinozytotischen Aufnahme von freiem antigenem Peptid, was für diese Domäne eine neue Funktion aufzeigt.

Translation of abstract (English)

Heat shock protein 70 (HSP70) and other molecular chaperones are used more and more for increasingly effective in tumor immunotherapy. HSP70 has a significant role in activating the APC and working as a carrier protein to deliver extracellular antigens to MHC class I molecules. Although the nature of high affinity receptors for HSP70 binding to the APC cell surface has still not been fully defined, four main classes of cell surface structure have been suggested, including the CD91 receptors, LOX 1 and CD40. CD91 has been proposed as a receptor for HSP70, GRP94, HSP90 and calreticulin on the cell surface of Raw264.7 cells. Both LPS treated and non treated Raw264.7 cells express CD91 on their cell surface, but the capacity to bind Hsp70 was abolished in these cells. Contrary to previously published data, untreated Raw309 Cr.1 cells did express CD91 on the cell surface, however no specific Hsp70 binding was observed. Upon treating the cells with LPS, binding of HSP70 was observed. CHOs expressing functional CD91 did not bind Hsp70. To address the question of CD40 and LOX 1 as putative receptors, competition experiments were performed. By using specific ligands no inhibition of N70 or C70 was observed. The data therefore indicate that CD91 and LOX 1 can be excluded as receptors for HSP70 binding. Consequently, the epitope of the CD40 antibody is not recognized as a putative connection domain for Hsp70. In addition, the expression of CD40 on the cell surface of Raw264.7 macrophages does not correlate with the binding of Hsp70. Therefore, CD40 can be excluded for Raw264.7 macrophages as mass receptor. The data introduced in this work show the existence of several, at least two, receptors for HSP70. APCs bind the HSP70 antigen complex in certain domains of the cell surface. The subunit C70 and N70 bind specifically in clear microdomains separate of each other on the cell surface. In addition, C70 binds raft domains, whereas N70 binds outside these areas. Under physiological conditions (37°C), the HSP70 antigen complex is taken up quickly and efficiently and an early separation of loaded and unloaded Hsp70 was observed. Shortly after the uptake of the Hsp70 antigen complex loaded HSP70 was found to be localised in Rab5 positive reticular structures, whereas after 20 min the unloaded Hsp70 was found in lysosomal compartments. Finally, results from CD8+ T-cell hybridoma system B3Z show that Hsp70 as well as C70 associated antigen, is presented on MHC class I molecules. The binding of N70 leads to an increase in the macropinocytosis of extracellular antigen, thus describing a new function for this domain.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Felix Wieland, Prof.
Date of thesis defense: 21. December 2006
Date Deposited: 01. Mar 2007 11:22
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Hitzeschockprotein , antigenpräsentierende Zellen , Kreuzpräsentationheat-shock protein , antigen presenting cells , cross presentation
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