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Funktionelle Charakterisierung der CK2-vermittelten Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors TIF-IA bei der Regulation der Synthese ribosomaler RNA

Bierhoff, Holger

English Title: Functional characterisation of CK2-mediated phosphorylation of the transcription factor TIF-IA in regulation of ribosomal RNA synthesis

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PDF, German
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Abstract

In Säugern wird die ribosomale RNA von RNA-Polymerase I (Pol I) synthetisiert. Die Interaktion der Pol I-spezifischen Faktoren TIF-IA und TIF-IB miteinander sowie die Bindung von TIF-IB an den rDNA-Promotor sind für die Transkriptionsinitiation notwendig. Ein Guanin an Position -7 (G-7) im core promoter element des rDNAPromotors ist nicht für die Bindung von TIF-IB, jedoch für eine effiziente rRNA Synthese notwendig. Wie im Rahmen dieser Arbeit gezeigt wurde, führt eine G-7->A Transition in vitro und in vivo zu einer starken Inhibierung der Promotoraktivität. Transkriptionsanalysen mit immobilisierten rDNA-Matrizen sowie abortive Transkriptionsexperimente wiesen auf eine Hemmung der Assoziation von TIF-IA mit dem rDNA-Promotor durch die G-7 Mutation hin. Jedoch haben Transkriptionsanalysen unter single round-Bedingungen und nach Depletierung von TIF-IA gezeigt, daß TIF-IA für die Transkription an der mutierten Matrize erforderlich ist. Somit scheint ein bislang unbekanntes Protein an der Ausbildung des Prä-Initiationskomplexes beteiligt zu sein, das an G-7 bindet. TIF-IA ist ein Phospho-Protein, das an mehreren Serinresten, unter anderem auch an Serin 170 und 172, phosphoryliert wird. Ziel dieser Arbeit war es, die Phosphorylierung dieser Serinreste funktionell aufzuklären und die entsprechende Kinase zu identifizieren. Durch Herstellung einer nicht-phosphorylierbaren Mutante (TIF-IAS170A/S172A) konnte gezeigt werden, daß die Serine 170 und 172 durch Casein-Kinase 2 (CK2) in vitro und in vivo phosphoryliert werden. Die Analyse der transkriptionellen Aktivität sowie die Expression von TIF-IAS170A/S172A in TIF-IA knockout Zellen ergaben, daß TIF-IA ohne die CK2-vermittelte Phosphorylierung nicht funktionell ist. In Co- Immunpräzipitationsexperimenten wurde nachgewiesen, daß die Inhibierung der Phosphorylierung von Serin 170 und 172 eine verstärkte Bindung von TIF-IA an Pol I bewirkt, während die Interaktion mit TIF-IB nicht beeinflußt wird. Mit Hilfe eines Antiserums, das spezifisch Phospho-Serin 170 und 172 in TIF-IA erkennt, wurde gezeigt, daß die CK2-vermittelte Phosphorylierung die Bindung von TIF-IA an Pol I verhindert. Aufgrund dieser Daten ist anzunehmen, daß TIF-IA nach der Transkriptionsinitiation von CK2 phosphoryliert wird und daß diese Phosphorylierung die Dissoziation von TIF-IA vom Elongationskomplex induziert. Diese CK2-vermittelte, reversible Phosphorylierung von TIF-IA ist somit für die produktive Elongation bzw. eine effiziente Re-Initiation essentiell.

Translation of abstract (English)

In mammals, the synthesis of ribosomal RNA is carried out by RNA polymerase I (Pol I). The interaction between the Pol I-specific factors TIF-IA and TIF-IB as well as the binding of the promoter selectivity factor TIF-IB to the rDNA promoter facilitate initiation of transcription. A guanine at position -7 (G-7) is not required for binding of TIF-IB to rDNA, but is needed for efficient rRNA synthesis. As shown in this study, a G-7->A transition strongly inhibits promoter activity both in vitro und in vivo. Abortive transcription assays and transcription experiments with immobilised rDNA templates suggested that binding of TIF-IA to the rDNA promoter is impaired due to the G-7 mutation. However, transcription assays under single round conditions and after depletion of TIF-IA revealed that transcription of the mutated template depends on TIF-IA. Therefore, a so far unidentified protein that binds to G-7 seems to take part in the formation of the pre-initiation complex. TIF-IA is phosphorylated at multiple sites, including two serine residues at position 170 and 172. The goal of this study was to elucidate the function of serine 170 and 172 phosphorylation in rDNA transcription and to identify the respective kinase. By establishing a phospho-ablation mutant (TIF-IAS170A/S172A) it was shown that both serine residues are phosphorylated in vitro and in vivo by casein kinase 2 (CK2). Analysis of transcriptional activity as well as expression of TIF-IAS170A/S172A in TIF-IA knockout cells demonstrated that TIF-IA is not functional if serine residues 170 and 172 can not be phosphorylated. Furthermore, co-immunoprecipitation experiments revealed increased binding of TIF-IA to Pol I after inhibition of CK2-dependent phosphorylation, whereas the interaction with TIF-IB was not affected. An antiserum was generated which specifically recognises phospho-serine residues 170 and 172 in TIF-IA and used to show that CK2-mediated phosphorylation prevents binding of TIF-IA to Pol I. This data suggest a model in which TIF-IA is phosphorylated by CK2 after transcription initiation to induce the dissociation of TIF-IA from the elongating Pol I complex. Thereby the CK2- dependent, reversible phosphorylation of TIF-IA might facilitate productive elongation and efficient re-initiation.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Grummt, Prof. Dr. Ingrid
Date of thesis defense: 9 March 2007
Date Deposited: 27 Mar 2007 09:11
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Genregulation, Phosphorylierung, Ribosomale RNS, Transkription <Genetik>
Uncontrolled Keywords: rRNA synthesis , transcription , phosphorylation , gene regulation
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