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Analysis of the role of the mineralocorticoid receptor in renal principal cell sodium reabsorption in vivo

Ronzaud, Caroline

German Title: Analyse der Rolle des Mineralokortikoidrezeptors in der renalen Rückresorption in vivo

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Germline inactivation of the mineralocorticoid receptor (MR) gene in mice results in early postnatal lethality due to massive loss of sodium and water associated with impaired epithelial sodium channel (ENaC) activity in kidney and colon. The aim of the present study was the analysis of the role of renal principal cell MR, which is activated by aldosterone, in ENaC-mediated sodium reabsorption. For this purpose, mice deficient for MR in ENaC-expressing renal principal cells were generated using the Cre-loxP recombination system. A large fragment of genomic mouse DNA harbouring 156 kb of the aquaporin 2 (AQP2) gene was used to drive the expression of Cre recombinase in principal cells (AQP2Cre mice). Mice carrying a conditional MR allele were crossed with AQP2Cre mice to obtain mutant (MRAQP2Cre) mice. MRAQP2Cre mice developped normally under standard diet and exhibited unaltered renal sodium excretion, but strongly elevated plasma aldosterone levels. When challenged with a low-sodium diet, MRAQP2Cre mice showed increased renal sodium and water excretion resulting in a continuous loss of bodyweight. Immunofluorescence for MR and ?ENaC staining revealed that the loss of MR expression is restricted to principal cells of the collecting duct (CD) and late connecting tubule (CNT), and that MR is crucial for apical ?ENaC trafficking to the apical membrane. The early CNT that accounts for about 30% of the CNT was not targeted. Determination of the fractional excretion of sodium before and after treatment with the ENaC blocker amiloride showed that renal ENaC activity in the mutant mice was preserved. These data demonstrate that the late distal convoluted tubule (DCT) and early CNT, which were not targeted in MRAQP2Cre mice, can compensate to a large extent impaired ENaC-mediated sodium reabsorption in the late CNT and CD. To overcome a possible postnatal lethality of the MRAQP2Cre mice, an inducible principal cell-specific gene inactivation system was established in parallel to induce MR inactivation in adult mice. The large genomic DNA fragment harbouring the AQP2 gene, used for the generation of the constitutive AQP2Cre transgene, was also used to drive the expression of the tamoxifen-inducible CreERT2 fusion protein (AQP2CreERT2 mice). Three AQP2CreERT2 transgenic lines containing 1, 4 and 9 copies of the transgene respectively were established and showed tamoxifen-induced recombination in most of the renal principal cells, but leakiness of the fusion protein in the papilla region of the kidney. To identify aldosterone-regulated genes potentially involved in the control of ENaC-mediated renal sodium reabsorption, gene expression profiling using microarrays was performed on a mouse renal cortical CD principal cell line (mpkCCDc14) in the presence or absence of aldosterone. Quantitative RT-PCR for the identified candidates on microdissected CDs from control mice fed with standard or low-sodium diet confirmed the induction by aldosterone of the genes encoding the serum- and glucocorticoid-regulated kinase 1 (Sgk1) and the ubiquitin-specific protease 2 (Usp2). Quantitative RT-PCR on microdissected CDs from control mice and principal cell MR-deficient (MRAQP2Cre) mice under low-sodium diet showed that the gene expression levels of Sgk1 and the serine/threonine protein kinase 3 (Pim3) were reduced in the mutant mice. Thus, these data identified Pim3 as a new MR-regulated gene involved in the control of ENaC-mediated sodium reabsorption.

Translation of abstract (German)

Die Keimbahninaktivierung des Mineralokortikoidrezeptor-(MR)-Gens in Mäusen führt infolge eines massiven Verlusts von Natrium und Wasser zu Lethalität in der 2. Woche nach der Geburt. Der Natrium/Wasser-Verlust geht einher mit einer gestörten Aktivität des epithelialen Natriumkanals (ENaC) in der Niere und im Kolon. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Rolle des MR in Aldosteron-aktivierten Hauptzellen des distalen Nierenepithels bei der Natrium-Rückresorption durch ENaC zu klären. Dazu wurden mit Hilfe des Cre-loxP-Rekombinationssystems Mäuse hergestellt, bei denen der MR in den Hauptzellen der Niere inaktiviert ist. Zur Expression der Cre-Rekombinase in Hauptzellen wurde ein 156 kB-großes Fragment genomischer Maus-DNA, das die regulatorischen Elemente des Aquaporin 2-Gens enthält, verwendet (AQP2Cre Mäuse). Zur Erzeugung von MR-defizienten Mäusen (MRAQP2Cre), wurden Mäuse mit einem konditionalen MR-Allel und AQP2Cre-Mäuse gekreuzt. Unter Standarddiät entwickelten sich MRAQP2Cre-Mäuse normal, ihre Natrium-Ausscheidung war nicht verändert, aber sie hatten stark erhöhte Aldosteron-Spiegel im Plasma. Bei Gabe vom Natrium-armen Futter zeigten MRAQP2Cre-Mäuse eine erhöhte renale Natriumausscheidung einhergehend mit erhöhter Urinproduktion, was zu einem kontinuierlichen Gewichtsverlust führte. Färbungen für MR und ?ENaC mittels Immunfluoreszenz zeigte einen Verlust des MR und der apikalen ENaC Expression selektiv in den Hauptzellen der Sammelrohre (CD) und den distalen Bereich der Verbindungsstücke (CNT). Der proximale Bereich des CNT, der etwa 30% der gesamten CNT ausmacht, war nicht von der Germinaktivierung betroffen. Eine Bestimmung der fraktionellen Natriumausscheidung vor und nach Behandlung mit dem ENaC-Blocker Amilorid ergab, dass die ENaC-Aktivität in der Niere insgesamt unverändert war. Diese Daten zeigen, dass in MRAQP2Cre Mäusen der Verlust des MR im distalen CNT und CD weitgehend kompensiert werden kann durch den distalen Konvolut (DCT) und den proximalen CNT, welche den MR weiterhin exprimieren. Um eine mögliche Lethalität der konstitutiven Inaktivierung des MR-Gens in den Hauptzellen des distalen Nierenepithels umgehen zu können, wurden parallel Mäuse mit einer induzierbaren MR-Inaktivierung hergestellt. Das selbe genomische Fragment, das für die Herstellung der AQP2Cre-Mäuse verwendet worden war, wurde zur Expression eines durch Tamoxifen-induzierbaren CreERT2-Fusionsproteins und zur Herstellung von AQP2CreERT2-Mäusen benutzt. Es wurden drei AQP2CreERT2-transgene Linien mit 1, 4 oder 9 Kopien erzeugt. Alle zeigten Tamoxifen-abhängige Rekombination, aber das Fusionsprotein wurde auch ohne Tamoxifen-Gabe in der Nierenpapille aktiviert. Zur Identifizierung von Aldosteron-regulierten Genen, die an der Kontrolle der Natrium-Rückresorption durch ENaC beteiligt sind, wurde eine Expressionsanalyse durch Hybridisierung von RNA aus einer Maus-Hauptzelllinie (mpkCCDc14) an DNA-Mikroarrays durchgeführt. Die mpkCCDc14-Zellen waren mit Aldosteron bzw. Vehikel behandelt. Die auf diese Weise gefundenen Kandidatengene wurden mittels quantitativer RT-PCR von RNA, die aus mikrodissezierten CD von Kontroll-Mäusen nach Standard- oder Natrium-armen Futter isoliert worden war, verifiziert. Auf diese Weise wurde die Induzierbarkeit der Serum- und Glukokortikoid-regulierten Kinase 1 (Sgk1) und der Ubiquitin-spezifische Protease 2 (Usp2) durch Aldosteron in vivo nachgewiesen. Quantitative RT-PCR von RNA am mikrodissezierten CD von Kontrollmäusen und von Mäusen mit einer selektiven MR-Mutation in Hauptzellen des distalen Nierenepithels (MRAQP2Cre), die unter Natrium-armen Futter gehalten wurden, zeigte eine verringerte Expression von Sgk1 und der Serine/Threonine Protein Kinase 3 (Pim3). Diese Expressionsdaten identifizieren Pim3 als neues MR-reguliertes Gen, das möglicherweise an der Kontrolle der ENaC-abhängigen Natrium-Rückresorption beteiligt ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schütz, Prof. Günther
Date of thesis defense: 19 March 2007
Date Deposited: 05 Apr 2007 10:11
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Transgene Tiere, Niere, Renin-Angiotensin-System, Natriumkanal
Uncontrolled Keywords: transgenic mice , kidney , renin-angiotensin-aldosterone system , sodium reabsorption , ENaC
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