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Die Rolle des Tumorsuppressors p53 für die TNF-alpha-vermittelte Induktion des MCP-1-Gens

Hacke, Katrin

English Title: The role of tumor suppressor p53 for the induction of the MCP-1 gene by TNF-alpha

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PDF, German
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Abstract

Das Immunsystem besteht aus hochspezialisierten Zellen und Molekülen, die in einer komplexen Beziehung miteinander agieren, um Pathogene zu detektieren und zu eliminieren. Chemotaktische Zytokine, so genannte Chemokine sind entscheidend an der Immunantwort beteiligt und bekannt für ihre Effekte bei der Anlockung und Aktivierung spezifischer Gruppen von Leukozyten. Das "Monocyte-Chemoattractant-Protein-1" (MCP-1/CCL2) ist ein wichtiges Mitglied der Chemokin-Familie und löst die Infiltration von Monozyten/Makrophagen aus. Die Expression von MCP-1 tritt bei verschiedenen Krankheiten, die durch den Einstrom von Monozyten charakterisiert sind, auf. Es gibt eindeutige biologische und genetische Hinweise, dass MCP-1 eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von Krankheiten, wie der Arteriosklerose, der Rheumatischen Arthritis und der Multiplen Sklerose, spielt. Zahlreiche Zellen, darunter Monozyten, Fibroblasten, vaskuläre Endothelzellen und glatte Muskelzellen produzieren MCP-1 in vitro als Antwort auf verschiedene proinflammatorische Stimuli, wie Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha). Das Gen, welches für MCP-1 codiert, ist ein "immediate-early" Gen. Die Induktion des MCP-1-Gens durch TNF-alpha wird auf der Ebene der Initiation der Transkription hauptsächlich durch einen Enhancer, der sich 2,2 bis 2,7 bp "upstream" zum Transkriptionsstart befindet, reguliert. Durch eine bioinformatische Analyse dieser 5'-Enhancer-Region wurde eine mögliche Bindungsstelle für p53 identifiziert. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob der Tumorsuppressor p53 in der durch TNF-alpha vermittelten Induktion von MCP-1 als Transkriptionsfaktor beteiligt ist. Transiente Transfektionen der Glioblastoma-Zelllinie A172 mit siRNA gerichtet gegen p53 Transkripte reduzierten die Induktion von MCP-1 durch TNF-alpha signifikant. Zusätzlich wurden Hep3B Zellen, stabil transfiziert mit temperatursensitiven p53val135, als Modell verwendet: bei 32°C, wenn p53val135 wtp53 Aktivität besitzt, wurde durch die Stimulation mit TNF-alpha die Transkription von MCP-1 induziert. Im Gegensatz dazu, wurde durch TNF-alpha bei 37°C und inaktivem p53val135 das MCP 1-Gen nicht aktiviert. Die physikalische Interaktion von p53 mit dem MCP-1 Enhancer konnte tatsächlich in p53 DNA Bindungsstudien (EMSA) gezeigt werden. Chromatin Immunopräzipitations- (ChIP) Assays ergaben, dass p53 nach der Stimulation mit TNF-alpha auch in vivo mit der identifizierten p53 Bindungsstelle interagiert. Dieses weist darauf hin, dass unter der Beteiligung des TNF-alpha Signaltransduktionsweg die Bindung von p53 an den MCP-1 Enhancer erfolgt. Daher liefert diese Arbeit nicht nur eine neue Perspektive, wie der Tumorsuppressor p53 an der Immunantwort durch die Modulation der Chemokin-Expression beteiligt ist, sondern liefert zusätzlich auch ein nützliches Modell, um die Vernetzung zwischen p53 und dem TNF-alpha Signaltransduktionsweg im Detail zu verstehen.

Translation of abstract (English)

The immune system consists of highly specialized cells and molecules interacting in a complex manner to detect and eliminate pathogens. Chemotactic cytokines, so called chemokines, are crucially involved in the immune response and known for their effects of attracting and activating specific subsets of leukocytes. The monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) is a prominent member of the chemokine family. MCP-1 triggers the infiltration of cells of the monocyte-macrophage lineage. Its expression occurs in a variety of diseases characterized by monocyte-rich infiltrates, and there is substantial biological and genetic evidence for its essential role in atherosclerosis, rheumatoid arthritis and multiple sclerosis. A wide variety of cells, including monocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells and smooth muscle cells produces MCP-1 in vitro in response to various proinflammatory stimuli such as lipopolysaccharide (LPS), interleukin-1 (IL-1) and tumor-necrosis factor-alpha (TNF-alpha). The gene coding for MCP-1 is an immediate early gene. The induction of the MCP-1 gene by TNF-alpha is regulated at the level of initiation of transcription mainly by an enhancer region located about 2.2 to 2.7 kb upstream. By bioinformatic analysis of this 5'-enhancer region a putative p53 binding site was identified. The purpose of this study was to determine whether the tumor suppressor p53 may be act as a transcription factor in the MCP-1 expression induced by TNF-alpha. Transient transfection of the glioblastoma cell line A172 with siRNA directed against p53 transcripts reduced the inducibility of the MCP-1 gene by TNF-alpha significantly. In addition Hep3B cells stably transfected with temperature sensitive p53val135 were used as a model system: temperature shift to 32°C resulted in wild-type properties of p53val135 and induction of MCP-1 transcription after stimulation with TNF-alpha. In contrast, TNF-alpha stimulation with inactive p53val135 at 37°C did not cause MCP-1 induction. Indeed, physical interaction of p53 with the MCP-1 enhancer could be shown in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments showed p53 DNA-interaction in vivo in a manner depending on TNF-alpha stimulation, indicating that the TNF-alpha pathway may be involved in the binding of p53 to the MCP-1 enhancer. Therefore, these data open new perspective of how the tumor suppressor p53 may be involved in the immune response through modulation of chemokine expression and provide a useful model for the crosstalk between p53 and the TNF-alpha pathway.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hilgenfeldt, Prof. Dr. Ulrich
Date of thesis defense: 12. April 2007
Date Deposited: 19. Apr 2007 10:48
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>, Protein p53, Chemokine, Genregulation
Uncontrolled Keywords: MCP-1chemokines , gene regulation , MCP-1 , TNF-alpha , tumor suppressor p53
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