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Genetic determinants of cell sensitization to parvovirus H-1-induced activation of non-apoptotic death pathways

Di Piazza, Matteo

German Title: Genetische bestimmende Faktoren von Zelle Sensibilisierung parvovirus H-1-induced zur Aktivierung der non-apoptotic Todesbahnen

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Abstract

Gliomas are the most common brain cancers, characterized by an exceptionally wide cellular heterogeneity and extreme migratory features. The structural development of these neoplasms renders surgical removal of the tumoral mass almost prohibitive and inefficient. Moreover, these tumors are often resistant to chemotherapy treatments as a result of the onset of survival mechanisms occurring during astrocytes malignant transformation and counteracting the induction of apoptotic cell death. An alternative therapeutic approach relies on the use of autonomous parvoviruses. These small, non enveloped, single-stranded DNA viruses are endowed with the capacity to kill malignant cells while being non-cytopathic towards healthy tissues. In particular, recent analyses on low passage cultures of human gliomas have demonstrated that the rodent parvovirus H-1 (H-1PV) induces death in cells resistant to conventional anticancer compounds. Among these, NCH82 cells have been chosen in this study to investigate the mechanisms of parvovirus H-1-induced glioma cell death. It has been observed that H-1PV triggers the formation of autophagic vesicles that are eventually involved in the cytosolic activation of lysosomal cathepsins B and L. The virus promotes efficient killing even in glioma cells overexpressing Bcl-2, an oncogene interfering with both apoptosis and autophagy induction. Besides, H-1PV-induced cathepsin B cytosolic activity is favoured by the down-regulation of cystatin B and C, two cathepsins inhibitors, and modulates caspase 3 induction. Glioma cells are protected from the viral lytic effect by autophagy inhibition, cathepsin B or L inactivation or cystatin B overexpression. Finally, cathepsin B in vivo activation upon parvovirus H-1 infection is associated with the regression of rat glioma cells intracranially implanted into recipient animals. To set the basis for an extensive future study on the identification of the key genetic alterations that render tumor cells permissive to H-1PV, a preliminary analysis has been conducted on rat embryo fibroblasts (REFs). Different immortalized and transformed phenotypes have been induced in these cells by overexpressing c-myc, SV40 large T antigen and activated Ha-ras oncogenes, or by inactivating the anti-oncogene p53. Programmed cell death activation has been further analyzed in this model system to correlate the genetic determinants of H-1PV sensitiveness with specific molecular events leading to virus-induced cell killing. This work demonstrates that c-myc overexpression is sufficient to render REFs permissive to H-1PV-mediated cytolysis. While the virus accomplishes cytosuppression of ras*/p53dn-transformed REFs by activating classical apoptosis, it triggers in all the other transfectants a non-apoptotic death pathway characterized by the cytosolic accumulation of autophagic vesicles and active cathepsin B. These observations indicate parvovirus H-1 as a potential novel therapeutic tool for cancer treatment through its ability to efficiently hijack both autophagic/cathepsins and apoptotic pathways, thus jeopardizing tumor cells survival.

Translation of abstract (German)

Gliome sind die häufigsten Hirntumoren. Sie weisen eine sehr hohe zelluläre Heterogenität auf und sind sehr stark migratorisch. Die strukturelle Entwicklung dieser Neoplasmen macht die chirurgische Entfernung des kompletten Tumorgewebes fast unmöglich. Desweiteren sind diese Tumoren oft resistent gegenüber Chemotherapien. Dies ist auf Mechanismen zurückzuführen, die das Übereleben der Zellen gewährleisten und die sich während der Entartung von Astrozyten zu bösartigen Tumorzellen entwickeln. Diese Mechanismen unterdrücken den apoptotischen Zelltod. Einen alternativen Therapieansatz stellt der Einsatz von autonomen Parvoviren dar. Diese kleinen, hüllenlosen, einzelsträngigen DNS Viren können maligne Zellen töten ohne dabei gesundes Gewebe zu gefährden. Vor allem neuere Untersuchungen an Kurzzeitkulturen menschlicher Gliome zeigen, dass das Nager Parvovirus H-1 (H-1PV) Zelltod in Zellen induziert, die resistent gegenüber konventionellen Therapien sind. Die NCH82 Zellen wurden in der vorliegenden Arbeit ausgewählt, um die Mechanismen des parvovirus-induzierten Zelltods von Gliomzellen zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass H-1PV die Bildung von autophagischen Vesikeln auslöst. Diese Vesikel sind dann an der zytosolischen Aktivierung der lysosomalen Cathepsine B und L beteiligt. Das Virus führt selbst in Gliomzellen, die Bcl-2, ein antiapoptotisches Protein, das auch Autophagie verhindern kann, überexprimieren, zu einer hohen Zelltodrate. Außerdem wird die H-1PV induzierte zytosolische Cathepsin B Aktivität durch die Herunterregulierung von Cystatin B und C, zwei Cathepsin Inhibitoren, begünstigt und moduliert die Caspase 3 Induktion. Die Inhibition der Autophagie, Cathepsin B oder L Inhibition sowie Cystatin B Überexpression schützen Gliomzellen vor der Virus-bedingten Lyse. Die in vivo Aktivierung von Cathepsin B nach Parvovirus H-1 Infektion führt zu einer Regression von intracranial implantierten Gliomzellen der Ratte. Um die Basis für intensive Untersuchungen zu schaffen hinsichtlich der Identifikation der wichtigsten genetischen Veränderungen, die dazu führen, dass Tumorzellen permissiv für H-1PV sind, wurde eine vorläufige Analyse an Fibroblasten von Rattenembryos (REFs) durchgeführt. Verschiedene immortalisierte und transformierte Phänotypen wurden in diesen Zellen induziert, indem die Onkogene c-myc, SV40, das large T antigen und aktiviertes Ha-ras überexprimiert wurden beziehungsweise das Tumorsuppressorgen p53 inaktiviert wurde. Die Aktivierung des programmierten Zelltods wurde in diesem Model weiterhin untersucht, um die genetischen Determinanten der H-1PV Sensitivität mit molekularen Ereignissen, die zu Virusinduziertem Zelltod führen, zu korrelieren. Diese Studie zeigt, das die Überexpression von c-myc ausreicht, um REFs permissiv gegenüber H-1PV vermittelter Zelllyse zu machen. Während das Virus in ras/p53dn-transformierten REFs klassische Apoptose induziert, löst es in all den anderen transformierten Zellen einen nicht apoptotischen Weg des Zelltods aus, der sich durch zytosolische Akkumulation autophagischer Vesikel und aktives Cathepsin B auszeichnet. Diese Beobachtungen offenbaren das Parvovirus H-1 als ein potenziell neues Werkzeug in der Krebstherapie, da es sowohl autophagische/Cathepsin-abhängige als auch apoptotische Wege des Zelltods in Tumorzellen induziert.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Petersen, Prof. Dr. Gabriele
Date of thesis defense: 17 April 2007
Date Deposited: 01 Jun 2007 10:48
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Glioblastom, Kathepsin B
Uncontrolled Keywords: nicht apoptotische Zell Totautophagy , lysosomal pathway , glioma , REFs , c-myc , parvovirus H-1
Additional Information: Teile in: J Virol. 2007 Apr;81(8):4186-98. Epub 2007 Feb 7. doi:10.1128/JVI.02601-06
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