Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Expressionsregulation der Sac1 Lipidphosphatase in Saccharomyces cerevisiae

Knödler, Andreas

English Title: Expression regulation of the sac1 lipid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae

[img]
Preview
PDF, German
Download (1907Kb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Phosphoinositide sind wichtige Lipidsignalmoleküle, die an der Regulation vieler intrazellulärer Vorgänge beteiligt sind. Sie werden durch das Zusammenspiel von spezifischen Lipidkinasen und Lipidphosphatasen reguliert, die selbst einer genauen Regulation unterliegen müssen. Die Lipidphosphatase Sac1p in Hefe kann PtdIns(4)P-Signale an Membranen des ER und Golgi-Apparates hydrolysieren. Dabei wird die räumliche Regulation und Koordination der katalytischen Aktivität von Sac1p durch einen Lokalisationswechsel zwischen ER und Golgi-Apparat gewährleistet. Außerdem wurde beobachtet, dass eine Regulation auf transkriptioneller Ebene stattfindet. So waren zelluläre Menge einer sac1- Variante mit reduzierter Phosphataseaktivität im Vergleich zu Wildtyp-Sac1p erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expressionskontrolle von SAC1 durch genetische und funktionelle Analysen untersucht. Mit Hilfe von verkürzten und mutierten Promotorkonstrukten konnte eine Region innerhalb des SAC1-Promotors identifiziert werden, die für die Transkription essentiell ist. So wurde gezeigt, dass die Deletion der Basen –100 bis –92 stromaufwärts des SAC1-Startcodons innerhalb des Gesamtlängepromotors zum Verlust der transkriptionellen Aktivität führt. Die Sequenz dieser essentiellen Region lautet ACCAGAGGT. Die jeweils äußeren drei Basen bilden dabei eine palindromartige Struktur aus. Mit Gelshiftanalysen konnte nachgewiesen werden, dass an die intakte Basensequenz ein bisher unbekannter Proteinfaktor bindet. Werden die jeweils äußeren drei Basenpaare deletiert, wird die Bindung des Proteinfaktors weitestgehend unterbunden. Wurden Oligonukleotide, die die spezifische Sequenz enthielten, an CNBr-Sepahrose gekoppelt, so war man in der Lage, spezifisch bindende Proteine in solchen Mengen aufzureinigen, die massenspektrometrischen Sequenzanalysen genügten. Jedoch konnte der bindende Faktor nicht identifiziert werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der SAC1-Promotor inositolsensitiv ist. Unter Inositolmangelbedingungen war die Promotoraktivität erhöht, Inositolüberschuss hatte eine Erniedrigung der Aktivität zur Folge. Zusammen mit dem bekannten Phänotpyen der Inositolauxotrophie einer sac1 D-Mutante, stellt dies einen Hinweis dar, dass die Expressionsregulation von SAC1 mit dem Lipidstoffwechsel gekoppelt ist. Die Analyse der SAC1-Expression im Zusammenhang mit der Regulation von Genen der Inositolbiosynthese hat jedoch ergeben, dass Inositol nicht das direkte Signal ist, welches die Promotoraktivität reguliert. Es konnte ebenfalls demonstriert werden, dass die Aktivität des SAC1-Promotors mit der intrazellulären PtdIns(4)P-Menge korreliert. So war der Promotor in sac1 D-Zellen, die durch zehnfach erhöhte PtdIns(4)P-Mengen charakterisiert wurden, deutlich aktiver. Wurden die sac1 D-Zellen mit temperatursensitiven Lipidkinasemutanten kombiniert, so sank die Aktivität des Promtors entsprechend der Reduktion von intrazellulärem PtdIns(4)P. Damit war ein Hinweis gefunden, dass intrazelluläres PtdIns(4)P das Signal sein könnte, das die Promotoraktivität von SAC1 steuert. Möglicherweise wird das Lipidsignal über spezifische lipidbindende Proteine von der Membran in den Nukleus transportiert. Mit Hilfe von biotinylierten, PtdIns(4)P-enthaltenden Lioposomen konnte eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt, nach PtdIns(4)P-interagierenden Faktoren zu suchen. Diese Methode kann nicht nur für die Charakterisierung der Bindeeigenschaften lipidbindender Proteine eingesetzt werden, sondern auch für die Aufreinigung von Proteinmengen, die für eine Detektion durch Coomassiefärbung ausreichend sind. Durch weitere Aufskalierungen sollte man in der Lage sein, auch weniger abundante Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit PtdIns(4)P interagieren können.

Translation of abstract (English)

Phosphoinositides are important signalling molecules involved in the regulation of many different cellular processes. They are controlled by the interactions of specific lipid kinases and phosphatases which in turn need to be highly regulated. The Sac1p lipid phosphatase in yeast can hydrolyze PtdIns(4)P signals at the ER and Golgi membranes. Its catalytic activity is spatially regulated by shuttling between these two compartments. Additionally, SAC1 is also regulated at a transcriptional level. Yeast strains harboring a sac1 mutant with reduced phosphatase activity showed elevated cellular levels of Sac1p compared to wildtype strains. This work uses genetic and functional analyses to study the transcriptional control of SAC1. Truncated and mutated versions of the SAC1 promotor allowed the identification of a region essential for transcriptional activity. Deletion of basepairs within the promotor region located at –100 to –92 upstream of the transcription start site resulted in loss of promotor activity. The sequence of this essential region is ACCAGAGGT. The three outer basepairs on each side represent a palindromic structure. With gel shift assays, a protein was found to interact specifically with this region of DNA. This interaction could be significantly weakened by mutating the three base pairs on either side. By coupling oligonucleotides harboring this DNA region to CNBr-activated Sepharose, proteins that bind specifically to this region could be enriched for and analyzed by mass spectrometry. However, the binding factor could not be identified. The SAC1 promotor was also found to be inositol sensitive. Upon inositol starvation, its activity was elevated, while an excess of inositol resulted in reduced activity. Together with the known inositol auxotrophy phenotype of sac1 D mutants, this lead to the hypothesis that expression regulation of SAC1 is coupled to lipid biosynthesis. However, analyses of the expression regulation of genes involved in inositol biosynthesis in combination with SAC1 expression studies revealed that inositol is not the signal directly regulating the promotor activity. We have shown that the activity of the SAC1 promotor is correlated with intracellular levels of PtdIns(4)P. In sac1 D mutants, which show 10-fold elevated levels of PtdIns(4)P, the promotor activity is also elevated. Combination of a sac1 D mutation with temperature-sensitive versions of lipid kinases resulted in reduced promotor activity alongside the observed reduction of intracellular PtIns(4)P in these strains. This lead to the conclusion that PtdIns(4)P signals might be involved in regulation of SAC1 expression. A lipid binding protein might be neccessary to translate the PtdIns(4)P signal into the nucleus. Using biotinylated liposomes containing PtdIns(4)P we developed a method useful for identification of novel PtdIns(4)P-binding proteins. We demonstrated that this method was suitable to study lipid-binding characteristics of known lipidbinding proteins, and allows purification of protein quantitites detectable by coomassie staining. To identify less abundant PtdIns(4)P-binding proteins further scaling-up might be necessary.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mayinger, Peter PD
Date of thesis defense: 27 April 2007
Date Deposited: 03 May 2007 07:19
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Phosphoinositide, Genexpression, Promotor
Uncontrolled Keywords: Lipidphosphatasephosphoinositides , gene expression , promoter , lipid phosphatase
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative