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Physiological role and quantitative aspects of human Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)

Viegas, Marcelo

German Title: Physiologische Rolle und quantitative Aspekte des humanen Nonsens-vermittelten mRNA Abbaus

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Abstract

Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a molecular pathway of mRNA surveillance that ensures the rapid degradation of mRNAs containing premature translation termination codons in all studied eukaryotes. Originally, NMD was thought of as a quality control pathway that targets non-functional mRNAs arising from mutations and splicing errors. More recently, NMD has been shown to also regulate normal gene expression and NMD thus emerged as one of the key post-transcriptional mechanisms of gene regulation. Despite the progress in the understanding of the role and mechanism of this pathway, the physiological impact of NMD on humans is not yet fully uncovered. To explore the functions of NMD in humans, I combined RNAi against the essential NMD factor UPF1 with genome-wide microarray analysis. My research indicate that NMD affects the expression of a large number of genes implicated in a wide diversity of functions although a majority seems to be affected indirectly and – consequently – do not represent legitimate NMD targets. The validation of five bona fide NMD transcripts allowed me to develop an assay to quantitate differences in NMD efficiency. Using three different strains of HeLa cells as a simple model, I have systematically analysed the molecular mechanism underlying quantitative differences in NMD efficiency. The results of this analysis show that the quantitative differences in NMD efficiency represent a stable characteristic of the investigated strains. Low NMD efficiency is shown to be functionally related to the reduced abundance of the exon junction component RNPS1 in one of the analysed HeLa strains. Furthermore, restoration of functional RNPS1 expression, but not of NMD-inactive mutant proteins, also restores efficient NMD in the RNPS1 deficient cell line. I conclude that cellular concentrations of RNPS1 can modify NMD efficiency and propose that the cell type specific co-factor availability represents a novel principle that quantitatively controls NMD. I also tested the hypothesis of NMD as a genetic modifier in the phenotypic expression of disease. A specific -thalassemia – common in Mediterranean Asia – was assayed as a model. My results do not support a role of NMD for the variable severity of this specific mutation leading to anemia.

Translation of abstract (German)

Der Nonsens-vermittelte mRNA Abbau (Nonsense-mediated mRNA decay; NMD) ist ein Bestandteil der zellulären Qualitätskontrolle aller Eukaryonten durch den mRNAs mit einem vorzeitigen Translationsterminationskodon beschleunigt abgebaut werden. Ursprünglich dachte man, dass NMD nur nicht-funktionelle mRNAs zerstört, die z.B. durch Mutationen oder Spleißfehler entstehen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass NMD auch die normale Genexpression reguliert. Daher wird NMD heutzutage als einer der zentralen Mechanismen der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression angesehen. Obwohl der molekulare Mechanismus des NMD zunehmend besser verstanden wird, ist noch wenig über die physiologische Bedeutung dieses Abbauwegs für den Menschen bekannt. In der vorliegenden Arbeit habe ich die transkriptionellen Auswirkungen von RNAi gegen den essentiellen NMD-Faktor UPF1 mittels einer genomweiten Microarray-Analyse untersucht, um die Funktion von NMD im Menschen besser zu verstehen. Meine Untersuchungen zeigen, dass NMD die Expression einer großen Zahl von Genen beeinflusst, welche an einer Vielzahl unterschiedlicher zellulärer Prozesse beteiligt sind. Höchstwahrscheinlich wird die Mehrzahl der identifizierten mRNAs jedoch durch indirekte Effekte in ihrer Expression verändert und stellt somit keine legitimen (d.h. direkten) NMD-regulierten Transkripte dar. Die Identifizierung von fünf validierten direkten NMD-regulierten mRNAs ermöglichte mir, ein experimentelles System zur Quantifizierung von Unterschieden der NMD-Effizienz zu etablieren. Auf der Basis von drei verschiedenen HeLa-Zelllinien als Modellsystem konnte ich systematisch den molekularen Mechanismus unterschiedlicher NMD-Effizienzen untersuchen. Ich konnte zeigen, dass die unterschiedliche NMD-Effizienz eine unveränderliche Eigenschaft jeder dieser Zelllinien darstellt. Die relativ schlechte NMD-Effizienz einer der Zelllinien wird durch eine verringerte Expression des Proteins RNPS1 verursacht. Eine Erhöhung der RNPS1 Expression bewirkt eine deutliche Steigerung der NMD-Effizienz bis auf ein normales Niveau. NMD-inaktive Mutanten von RNPS1 zeigen jedoch nicht denselben Effekt. Die Konzentration von RNPS1 in der Zelle stellt also eine der Determinanten der NMD-Effizienz dar. Die Zelltyp-spezifische Verfügbarkeit von NMD-Faktoren ist somit ein neuartiger molekularer Mechanismus, der quantitativ die Wirklung von NMD durch seine Effizienz kontrolliert. Weiterhin habe ich untersucht, ob NMD generell die phenotypische Ausprägung von Erkrankungen als ein modifizierender genetischer Faktor verändern kann. Eine bestimmte Form der b-Thalassämie, die insbesondere im Nahen Osten verbreitet ist, wurde als experimentelles Modellsystem untersucht. Meine Ergebnisse zeigen jedoch, dass die unterschiedliche Schwere der Erkrankung in den untersuchten Fällen wahrscheinlich nicht durch unterschiedliche NMD-Effizenz verursacht wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mattaj, Prof. Dr. Iain
Date of thesis defense: 23 April 2007
Date Deposited: 03 May 2007 11:33
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Exon-Exon-Junction-Complex, Nonsensmutation
Uncontrolled Keywords: mRNA decay , RNPS1
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