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Engineering a synthetic p53-Mdm2 network in budding yeast

Di Ventura, Barbara

German Title: Technik eines synthetischen Netzes p53-Mdm2 in knospender Hefe

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Abstract

p53 is among the most thoroughly studied proteins to date. Its tumour suppressor activity and the consideration that inactivation of the p53 pathway is a common, if not universal, feature of all human cancers, have gained it the interest of a multitude of researches seeking new therapies against this disease. As a consequence, p53 is at the centre of a feverish research and nowadays is reported to be involved in most cellular processes. Despite the vast amount of data published, much is yet to be unravelled about the mechanisms regulating the p53 signalling network. Indeed, the p53 network is extremely intricate and complex, and from a system biology point of view it can be seen as a series of interconnected negative and positive feedback loops, which can give rise to complex dynamics such as oscillations. In the combined effort to understand more of the biological meaning of these oscillations and to study the properties of this network motif from an engineering perspective, a synthetic p53 network has been built in budding yeast with the aim of studying the network in isolation while being embedded in living cells. p53 and most proteins in the network are absent from the budding yeast genome. This diminishes the likelihood of interferences on the engineered module from the cellular environment. Surprisingly, despite the evolutionary conservation of the ubiquitin pathway from yeast to humans, p53 ubiquitylation by the E3 ubiquitin ligase Mdm2 - an event central to the oscillatory dynamics of the system - does not appear to take place in budding yeast, even when the human E2 enzyme UbcH5B is exogenously expressed. p53 is instead sumoylated by Mdm2 and sumoylation dictates the co-localization of p53 and Mdm2 to a nuclear body reminiscent of human PML bodies. In conclusion, attempting to rebuild from scratch a simplified version of the intricate p53 network, isolating it from its natural context, has proven to be a very powerful means leading to unexpected findings, testifying the usefulness of the synthetic biology approach.

Translation of abstract (German)

p53 gehört zu den bislang am häufigsten untersuchten Proteinen. Seine Rolle als Tumorsupressor und die Tatsache, dass der p53 Signalweg in den meisten, wenn nicht gar allen, menschlichen Krebsarten blockiert ist, weckte das Interesse zahlreicher Forscher auf der Suche nach neuen Therapien. Infolge seiner fieberhaften Erforschung findet man dieses Protein inzwischen an den meisten zellulären Vorgängen beteiligt. Trotz dieser enormen Datenmenge ist die Regulation des p53 Signalnetzwerkes aber noch keineswegs verstanden. Tatsächlich ist das p53 Netzwerk extrem verschlungen und komplex. Aus Sicht der Systembiologie stellt es sich als eine Aneinanderreihung miteinander vernetzter positiver und negativer Rückkopplungsschleifen dar, deren komplexe Dynamik zum Beispiel zur Ausbildung von Oszillationen führen kann. Um einerseits die biologische Funktion dieser Oszillationen zu verstehen, sowie andererseits die Eigenschaften des Netzwerkes unter systembiologischen Aspekten zu untersuchen, habe ich ein synthetisches p53 Netzwerk in Sprosshefe eingeführt. Dies erlaubte die Untersuchung des Netzwerkes in lebenden Zellen bei gleichzeitiger Entkopplung von der natürlichen Umgebung; p53 und die meisten der mit ihm verbundenen Proteine fehlen im Genom der Sprosshefe. Dies verringert die Gefahr von Wechselwirkungen zwischen dem synthetischen Modul und der Wirtszelle. Erstaunlicherweise, trotz der evolutionären Erhaltung des Ubiquitin-Signalwegs zwischen Hefe und Menschen, wird p53 in Hefezellen nicht von der E3 Ubiquitin Ligase Mdm2 ubiquitiniert. Diese Reaktion spielt im menschlichen System eine Schlüsselrolle bei der Ausbildung von Oszillationen. In Hefezellen bleibt sie jedoch selbst dann aus, wenn das menschliche E2 Enzym UbcH5B zusätzlich exprimiert wird. Stattdessen wird p53 von Mdm2 sumoyliert, und diese Sumoylierung führt zur Co-Lokalisierung von Mdm2 und p53 in einem Kernkkörper mit Ähnlichkeit zu menschlichen PML-Körpern. Der Versuch, eine vereinfachte Version des p53 Netzwerkes ausserhalb seiner natürlichen Umgebung aufzubauen, erwies sich schliesslich als hervorragender Weg zu neuen Erkenntnissen und bestätigt den Forschungsansatz der synthetische Biologie.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Serrano, Dr. Luis
Date of thesis defense: 23. November 2006
Date Deposited: 05. Jun 2007 10:07
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: cellular biologie
Uncontrolled Keywords: cell biology , p53 , mdm2 , synthetic network
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