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Strategies for High Quality Quantitative Data Generation and Dynamic Modeling of the MAP-Kinase Signaling Cascade

Schilling, Marcel

German Title: Strategien zur Erhebung qualitativ hochwertiger quantitativer Daten und dynamische Modellierung der MAP-Kinase Signalleitungskaskade

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Abstract

Systems biology aims at understanding how living organisms function in health and fail in disease by studying how new properties arise from dynamic interactions. Beyond qualitatively analyzing static data of individual components, dynamic quantitative data are combined with mathematical modeling to elucidate systems properties that determine cellular decisions. Such cell fate decisions are taken during erythropoiesis, when erythroid progenitor cells mature to erythrocytes by tightly regulated proliferation and differentiation processes, which are dependent on the cytokine erythropoietin (Epo) and the signaling transduction network activated by its receptor (EpoR). A major bottleneck in systems biology is the lack of high-quality quantitative data. Therefore, we developed strategies for error reduction and algorithms for automated data processing, establishing the widely used techniques of immunoprecipitation and immunoblotting as highly precise methods for the quantification of protein levels and modifications. By randomized gel-loading we prevented correlated errors and further improved our data using housekeeping proteins or adding purified proteins to immunoprecipitation in combination with criteria-based normalization, enabling the generation of large and accurate sets of quantitative data. Dysfunctional signaling in erythroid progenitor cells is associated with diseases such as anemia and leukemia, but the effects of interfering with the MAP-kinase signaling network are unknown. To causatively understand cell fate decisions and be able to predictably manipulate growth and maturation of erythroid progenitor cells, we applied a systems biology approach. We monitored components of the Epo-induced MAP-kinase network after stimulation of primary murine erythroid progenitor cells by quantitative immunoblotting. A dynamic mathematical model was compiled and kinetic parameters were estimated by multi-parameter fitting algorithms. We predicted that an increase in expression of a single ERK isoform would lead to feedback-mediated rerouting of signaling, which was confirmed by isoform-specific protein overexpression. The model was extended based on two hypotheses of negative feedback mechanisms. We experimentally confirmed feedback inhibition by phosphorylation as expressing a kinase-defective ERK isoform resulted in similar phenotypes as overexpression of the wild-type isoform. We demonstrated the influence of the integrated response of activated ERK on erythroid proliferation and differentiation, demonstrating that hyperactivation of the MAP-kinase signaling network leads to accelerated erythropoiesis but surprisingly to reduced hemoglobinization. The input for signaling is critically dependent on the receptor presence on the cell surface. Endocytosis of cell surface receptors was thought to be responsible for long-term adaptation of a cell to a continuous stimulus. However, it remained to be identified what induces the rapid decline in signal transduction after activation of a cell surface receptor. We performed dynamic modeling of EpoR endocytosis, showing that the majority of internalized Epo is recycled to the medium. Sensitivity analysis revealed that the constant turnover of the receptor on the plasma membrane and ligand-induced internalization determine the sharp peak of EpoR activation. Furthermore, we predicted that the binding kinetics, but not the binding affinity determine the strength of EpoR signaling. Surprisingly, receptor internalization is crucial for rapid activation and deactivation of signaling, but irrelevant for long-term desensitization of cells. In conclusion we employed mathematical modeling based on high-quality quantitative data, providing computational models of Epo-induced receptor endocytosis and MAP-kinase activation. Our systems biology approaches provided counterintuitive results that could not be obtained by conventional methods. For example, overexpression of an ERK isoform leads to rerouting of signaling and endocytosis of the EpoR is not required for long-term termination, but for rapid activation and deactivation of signaling. Furthermore, the mathematical models enable the identification of general systems properties and the sensitivity analyses predict targets for efficient interventions. In the future, this information can be used for drug design, opening new possibilities for treatments of anemia and leukemia.

Translation of abstract (German)

Im Rahmen der Systembiologie werden neue Eigenschaften untersucht, die durch dynamische Wechselwirkungen von Einzelkomponenten entstehen. Dazu werden nicht nur qualitative statische Daten von Einzelmolekülen eingesetzt, sondern dynamische quantitative Daten in Kombination mit mathematischen Modellen untersucht. Auf diese Weise können entscheidungsbestimmende Systemeigenschaften identifiziert werden und Einblick in die Funktionsweisen von Lebewesen und in die Entstehung von Krankheiten erhalten werden. Präzise regulierte Proliferations- und Differenzierungsprozesse ermöglichen während der Erythropoese eine Expansion und Reifung der erythroiden Vorläuferzellen zu Erythrozyten. Diese Prozesse werden entscheidend von dem Zytokin Erythropoietin (Epo) und dem Signaltransduktionsnetzwerk des dazugehörigen Rezeptors (EpoR) bestimmt. Gegenwärtig mangelt es in der Systembiologie an qualitativ hochwertigen quantitativen Daten. Wir haben Strategien zur Fehlerreduktion und Algorithmen zur automatischen Datenverarbeitung entwickelt und Immunpräzipitation und Immunoblot als hochpräzise Quantifizierungsmethoden für Proteinmengen und Proteinmodifikationen etabliert. Das randomisierte Laden der Proben auf Proteingele verhindert korrelierte Fehler. Die Datenqualität konnte durch kriteriengestützte Normierung basierend auf konstant exprimierten Proteine oder hinzugefügten Proteinstandards deutlich verbessert werden. Auf diese Weise können umfangreiche und genaue quantitative Datensätze erzeugt werden. Um zelluläre Entscheidungsfindungen ursächlich zu verstehen und um gezielt Wachstum und Reifung von erythroiden Vorläuferzellen beeinflussen zu können, haben wir einen systembiologischen Ansatz zur Analyse des von Epo aktivierten MAP-Kinase-Signalleitungsnetzwerk eingesetzt. Nach Stimulation von primären murinen erythroiden Vorläuferzellen wurden Bestandteile des MAP-Kinase-Signalweges mittels quantitativem Immunoblot untersucht. Ein dynamisches mathematisches Modell wurde etabliert und die kinetischen Parameter durch Mehrparameter-Anpassungsalgorithmen geschätzt. Modellverhersagen ergaben, dass eine Erhöhung des Expressionslevels einer einzelnen Isoform von ERK zu einer rückkoppelungsvermittelten Umleitung des Signalweges führen würde. Dies konnte durch isoform-spezifische Proteinüberexpression experimentell bestätigt werden. Das datenbasierte Modell wurde um zwei Hypothesen über den negativen Rückkoppelungsmechanismus erweitert. Die Rückkoppelungsinhibierung durch Phosphorylierung konnte experimentell bestätigt werden, da die Überexpression von ERK-Isoformen sowohl ohne als auch mit Kinaseaktivität zu gleichartigen Phänotypen bezüglich erythroider Proliferation und Differenzierung führte. Dabei konnten wir nachweisen, dass eine Überaktivierung des MAP-Kinase-Signalleitungsnetzwerkes zu schnellerer Differenzierung, überraschenderweise aber auch zu einer reduzierten Hämoglobinisierung führt. Die Signalumsetzung hängt entscheidend von der Rezeptoranzahl an der Zelloberfläche ab. Es wird angenommen, dass die Endozytose von Zelloberflächenrezeptoren verantwortlich für die langfristige Anpassung einer Zelle an einen anhaltenden Stimulus ist. Durch dynamische Modellierung der Endozytose des EpoR konnte nachgewiesen werden, dass der Grossteil des internalisierten Epo in das Medium zurückgeschleust wird. Sensitivitätsanalysen zeigten, dass der konstante Umsatz des Rezeptors an der Plasmamembran und die ligandeninduzierte Internalisierung den steilen Anstieg und die schnelle Abnahme der Rezeptoraktivität in der Anfangsphase bestimmen. Außerdem wurde vorausgesagt, dass die Bindungskinetik und nicht die Bindungsaffinität die Signalstärke das EpoR ausmachen. Da der internalisierte Rezeptor nach anfänglicher Abnahme in erheblichem Ausmaß wieder an die Oberfläche zurückkehrt, ist die Rezeptorinternalisierung überraschenderweise ausschlaggebend für die rasche Signalaktivierung und –deaktivierung, aber unerheblich für die langfristige Desensibilisierung der Zelle. Zusammenfassend wurden qualitativ hochwertige quantitative Daten mit mathematischen Modellen kombiniert und dabei Computermodelle der Epo-induzierten Endozytose und MAP-Kinase Signalaktivierung erstellt. Die systembiologischen Ansätze lieferten überraschende Resultate, die nicht mit herkömmlichen Methoden erzielt werden konnten: Die Überexpression einer ERK-Isoform führt zur Umleitung des Signalweges und die Endozytose des EpoR beeinflusst die rasche Aktivierung und Deaktivierung der Signalleitung. Die datenbasierten Modelle ermöglichen außerdem die Identifizierung von allgemeingültigen Systemeigenschaften und durch Sensitivitätsanalysen die Vorhersage von Angriffspunkte für effiziente Interventionen. In Zukunft können solche datenbasierte Modelle für die gezielte Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden und eröffnen auf diese Weise neue Möglichkeiten zur Therapie von Anämien und Leukämien.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Klingmüller, Dr. PD Ursula
Date of thesis defense: 24. May 2007
Date Deposited: 30. May 2007 08:53
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Systembiologie, Signaltransduktion, Erythropoese, MAP-Kinase, Immunoblot, Quantitative Methode, Zelldifferenzierung, Erythropoietin, Endocytos
Uncontrolled Keywords: systems biology , erythropoiesis , MAP-kinase , quantitative immunoblotting , data processing
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